牛源多杀性巴氏杆菌PlpE蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

为体外表达牛源多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)PlpE基因及制备抗PlpE蛋白多克隆抗体,根据PlpE基因核酸序列设计了1对特异性引物,通过PCR扩增PlpE基因,构建重组质粒pET-32a-PlpE;摇菌提取质粒,进行双酶切鉴定,鉴定正确后将重组质粒pET-32a-PlpE转化至BL21(DE3)感受态细胞,加入IPTG进行诱导,对诱导蛋白进行SDS-PAGE和Western Blot鉴定;使用纯化蛋白PlpE免疫北京大耳白兔,制备多克隆抗体,并进行间接ELISA和Western Blot分析。结果显示,扩增的PlpE基因大小为1050 bp,在原核细胞中诱导表达的PlpE蛋白约56 kDa。间接ELISA结果显示,所制备多克隆抗体效价可达1:512000;Western Blot结果显示,所制备多克隆抗体反应性良好。PlpE蛋白的成功表达和多克隆抗体的成功制备,为下一步多杀性巴氏杆菌诊断方法的建立和疫苗研发奠定了基础。

溶血性曼氏杆菌PlpE基因原核表达及间接ELISA方法的建立

为了建立一种能够方便、高效检测溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica)的方法,试验将溶血性曼氏杆菌重组质粒pET-32a-PlpE转化至BL21(DE3)感受态细胞,然后经IPTG诱导表达并纯化。以重组蛋白PlpE为包被抗原,通过优化抗原最佳包被浓度、一抗及二抗最佳稀释度、最佳反应时间和最佳显色时间等试验条件,建立了检测PlpE抗体的间接ELISA方法。结果表明:重组质粒pET-32a-PlpE转化至感受态细胞BL21(DE3)后利用IPTG诱导,重组蛋白主要在沉淀中大量表达,经包涵体纯化试剂盒纯化后获得纯度较高的目的蛋白。重组蛋白PlpE具有良好的反应性,且蛋白大小符合预期。确定的检测条件为抗原包被浓度2μg/mL,一抗稀释度1∶300,酶标二抗稀释度1∶80 000,反应时间45 min,一抗反应时间30 min,显色时间15 min。用该方法检出溶血性曼氏杆菌阳性血清的最低效价可达1∶1 280,检测牛病毒性腹泻病毒阳性血清、牛传染性鼻气管炎病毒阳性血清、口蹄疫病毒阳性血清、副结核分枝杆菌阳性血清、布鲁氏杆菌阳性血清,结果均为阴性;批内重复性试验和批间重复性试验变异系数分别为0.70%~4.70%和0.50%~5.60%,均小于6.00%,该方法重复性较好。说明本试验建立的检测PlpE抗体的间接ELISA方法具有较高的敏感性和特异性,可用于临床牛血清抗体的检测。

禽多杀性巴氏杆菌PlpE基因的PCR扩增检测

多杀性巴氏杆菌是一种重要的人畜共患病的病原菌,有许多不同的血清型,可使多种动物感染发病,禽霍乱是其中之一,其主要特征为引起家禽发生腹泻、呼吸困难、发热等症状,此病严重危害畜禽养殖业的发展。据报道[1],禽多杀性巴氏杆菌PlpE基因可编码一种具有较好的交叉免疫保护性的外膜脂蛋白抗原。本实验先将目的细菌进行培养增殖,而后提取细菌总DNA并进行琼脂糖凝胶电泳,最后运用核酸PCR扩增技术检测扩增PlpE基因,以确定分离获得细菌株是否具有PlpE基因,从而判定该菌致病性的大小,为禽巴氏杆菌病的快速诊断奠定初步的基础。

牛源多杀性巴氏杆菌融合基因pm0979-PlpE的表达及其融合蛋白的免疫效果

为研究多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)pm0979-PlpE融合蛋白的免疫效果,本研究分析获得了主要抗原表位基因pm0979、PlpE,并将2个抗原表位通过疏水性linker进行拼接融合,构建了原核表达载体pET-30a-pm0979、pET-30a-PlpE及pET-30a-pm0979-PlpE,并将构建成功的载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行表达从而获得融合蛋白。纯化重组蛋白并用其免疫小鼠,二免后,测定抗体产生情况,并进行牛源Pm CQ2株及Pm B型攻毒试验,测定各自对小鼠的交叉保护效果。结果显示,3种重组蛋白都能诱导机体产生较高水平的抗体并具有交叉保护作用,但抗原表位融合的重组蛋白pm0979-PlpE的交叉保护效果最好,分别达80%(Pm CQ2株)和40%(Pm B型)。上述研究结果初步提示了该融合蛋白作为预防多杀性巴氏杆菌疾病的可行性,为研制新型广谱的多杀性巴氏杆菌疫苗奠定了基础。

猪源多杀性巴氏杆菌PCR鉴定方法的建立

为建立一种灵敏、特异的猪源多杀性巴氏杆菌PCR检测方法,根据GenBank已公布的多杀性巴氏杆菌plpE基因序列的保守片段设计合成引物,经plpE基因阳性质粒构建、反应条件的优化、特异性试验和敏感性试验,对猪源多杀性巴氏杆菌特异性PCR检测方法进行了研究;并将该PCR方法用于检测来自四川省6个规模化猪场的64份疑似多杀性巴氏杆菌肺部组织样品。结果显示,建立的PCR方法具有良好的特异性和敏感性,检测的敏感性为5×101拷贝的目的基因;多杀性巴氏杆菌(A、B、D血清型)PCR均为阳性、APP和HPS等病原均为阴性;64份临床疑似样品中检出36份样品阳性,阳性检出率为56.2%。以plpE基因初步建立的多杀性巴氏杆菌PCR检测方法具有较好的特异性、重复性、敏感性和可靠性,可用于多杀性巴氏杆菌的检测鉴定。

磷脂体系的同步辐射SXAS研究

用同步辐射小角X射线散射(SAXS)技术检测正己烷中磷脂形成的反相胶束在氧化不同时间后结构的变化。含亚油酸链和磷脂酰乙醇胺的磷脂(PLPE)体系的SAXS数据表明PLPE在这个体系中高度分散;PLPE形成的散射粒子比其它磷脂体系的直径大,有较长的椭球形结构。磷脂样品氧化3d后,散射粒子存在两种不同粒径分布;经过一定沉降过程,氧化6d后的散射粒子最大颗粒的粒径分布曲线更窄,表明3d的氧化时间是氧化过程的一个临界点。

兔出血症病毒和多杀巴氏杆菌嵌合蛋白VP60-Plp E的构建及其免疫原性鉴定

兔病毒性出血症(兔瘟)和兔巴氏杆菌病是对家兔危害最严重的两种疫病。用于防控这两种疫病的二联灭活疫苗存在着生产成本偏高问题。虽然基因工程亚单位疫苗的应用有助于提升二联苗的效力,但是生产成本依然偏高。本研究的目的是获得一种嵌合了巴氏杆菌保护性抗原PlpE的表位的兔出血症病毒VP60重组蛋白。首先通过Bepipred-2.0分析,确定PlpE的免疫显性区域主要位于N端。然后将编码PlpE26-45位、51-95位氨基酸序列的基因片段连接到VP60基因的5’端和3’端,并通过杆状病毒-昆虫细胞表达系统获得嵌合了PlpE表位的重组蛋白VP60-PlpE。血凝试验显示VP60-PlpE具有明显的血凝活性,提示重组蛋白仍然能够形成病毒样颗粒。Western blot实验结果表明VP60-PlpE与PlpE抗血清反应明显。小鼠免疫保护力实验表明VP60-PlpE对巴氏杆菌具有免疫保护力。家兔免疫保护力实验表明VP60-PlpE对兔出血症病毒和巴氏杆菌均具有免疫保护作用。总之,本研究成功构建出一种嵌合了巴氏杆菌保护性表位的兔出血症病毒VP60,为研制更低成本的兔病毒性出血症、兔巴氏杆菌病亚单位疫苗提供了基础。

基于数据挖掘的地下燃气管道风险指标体系设计

针对风险模型的建立进行建模指标集的确定。鉴于指标数量多,相关关系错综复杂,先后采用了多种数据挖掘方法:专家调研法、最小均方差法、极小极大离差法逐步对指标进行筛选。并根据各指标对地下燃气管道影响的方式不同,指标间相关关系的差异确定了三层结构的风险模型指标体系,采用从三级、二级到一级指标的逐级量化方案。运用专家评分法在综合指标信息方面的优势,避开其由于指标集过大而导致评分的偏差,在小指标集内进行指标量化。将层次分析法运用到处理专家意见,确定指标权重的过程中。

重力热管锅炉在余热回收中的应用

概述了热管的基本原理与重力热管锅炉的形式和结构,并对重力热管锅炉在余热利用中的的应用特点进行了比较分析,指出重力热管锅炉具有广阔的应用前景和发展潜力。

排管敷设情况下电缆额定载流量研究之二——载流量理论计算

利用镜像法和叠加原理,建立了排管敷设的几种不同情况下电缆载流量理论计算的模型,并进行计算;对部分敷设情况下的载流量计算值进行了试验验证,进而说明本文所建立的模型是合适的,理论计算值与试验值的误差仅为2%左右,这将为今后电缆排管敷设情况下的载流量计算奠定了理论基础。

住宅小区排水合流管保留用作雨水管研究

住宅小区原有的排水合流管保留用作雨水管,可节约大量的工程投资。文章介绍了对合流管保留条件中的两个主要条件—承载能力与渗漏状况,分别采用外压荷载破坏试验和闭水试验所进行的研究,并对结果予以分析。

鼻内镜下慢性泪囊炎伴泪道狭窄的扩张管植入术式的探讨

目的：探讨鼻内镜下慢性泪囊炎伴泪小管狭窄手术中扩张管植入、固定方式.方法：选择确诊为慢性泪囊炎并伴泪小管狭窄患者50例（55眼）,采取鼻内镜下鼻腔泪囊造口、植入扩张管并固定于中鼻甲.结果：治愈35眼（63.6%）,好转16眼（29.1%）,无效4眼（7.3%）,总有效率92.7%.结论：本手术方式,选材容易,操作简单,固定牢靠,能长时间置管扩张而患者无明显不适,经济安全有效.

集中空调水系统优化设计的电算原理、方法及其应用

空调水系统设计是空调系统设计的重要内容之一。改变传统的设计方法和计算手段,提高设计质量和效率是设计发展的必然趋势。利用图论和管网电算理论开发的计算机程序能够实现空调水系统设计中管段流量分配的计算、管径选择、系统总阻力和调节参数的计算、水泵和平衡阀的选型等功能。本文介绍了集中空调水系统设计的电算程序编制的原理和方法,以及在某工程空调系统设计中的应用。实践证明该程序的应用可以大大减少设计人员的计算工作量,提高设计的质量和效率。

环空套管内粘弹性流的解析解

本文讨论了二阶流体和 Maxwell流体在环形套管内的轴向不定常旋转运动 ,给出了与文 [1 ]不同形式的解析解 ,修正了该文的结果 .