Taq DNA聚合酶的分子改造及其在探针法qPCR直扩体系中的应用

Taq DNA聚合酶作为实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)技术的核心组分,其性能优劣直接影响qPCR技术的进一步发展。然而,野生型Taq DNA聚合酶的耐抑制剂性能差、延伸性能不足。为获得具有高性能的Taq DNA聚合酶,采用基因工程技术将双链DNA结合蛋白Sso7d或Sto7d融合在野生型Taq DNA聚合酶的N端或C端,构建了4个均可溶表达的改造体,再经过耐受性测试筛选较优的改造体,结果显示:改造体Taq-Sto的耐受性最高,其热稳定性不受影响,且在1 s/kbp的延伸条件下能成功扩增靶标,表明Taq-Sto具有增强的延伸性能,在TaqMan探针法qPCR体系中对腐殖酸、单宁酸、全血等抑制剂同样表现出良好的耐受性。EMSA实验发现:Taq-Sto对DNA模板的结合亲和力有所提高,有利于增强Taq-Sto对模板的竞争力;将Taq-Sto应用于非洲猪瘟病毒(ASFV)的TaqMan探针法qPCR检测,与商品化试剂相比,Taq-Sto具有更低的ASFV检出限,且在体积分数为2%~6%的猪粪便样本或猪肉样本中的检测灵敏度分别为100.0%和85.4%,说明Taq-Sto在直扩qPCR检测领域更具有优势。

血清中DNA聚合酶α在阿尔茨海默病中的表达和诊断价值分析

目的探究血清中DNA聚合酶α(DNA polα)在阿尔茨海默病(AD)中的表达水平,分析其在AD中的诊断价值。方法选取2019年3月至2023年4月在首都医科大学宣武医院就诊的AD痴呆(DAT)期患者100例作为DAT组,轻度认知障碍(MCI)期患者43例作为MCI组;同期,选取68例同年龄组别的健康者作为HC组。检测各组血清样本中DNA polα的表达水平,利用受试者工作特征(ROC)曲线分析DNA polα在AD中的诊断价值。结果DAT组血清DNA polα表达水平高于MCI组(P<0.05)和HC组(P<0.001),随着AD病程发展,DNA polα表达水平有递增趋势。DNA polα表达水平与简易智能精神状态检查量表(MMSE)和蒙特利尔认知评估量表(MoCA)评分均呈负相关(r=-0.1553、-0.2037,P<0.05)。DNA polα诊断DAT期的曲线下面积(AUC)为0.682,灵敏度为0.900,特异度为0.412;DNA polα诊断MCI期的AUC为0.546,灵敏度为0.977,特异度为0.250;DNA polα鉴别诊断MCI期和DAT期的AUC为0.664,灵敏度为0.780,特异度为0.535。结论DNA polα在DAT期AD患者中表达水平升高,且其表达水平与AD病程发展存在一定联系,推测DNA polα有可能是诊断AD潜在的血液生物标志物。

DNA聚合酶θ:易错的多功能DNA末端修复分子

DNA聚合酶θ(DNA polymerase theta,Polθ)是一种广泛存在于动植物中的DNA修复酶。它在选择性末端连接(alternative end-joining,Alt-EJ)途径中发挥着关键作用,常参与DNA双链断裂(DNA double-strand breaks,DSB)损伤修复。在正常生理状态下,Polθ主要调控基因组稳定性。然而,在恶性肿瘤发生时,Polθ表现出异常高表达水平,并参与调控肿瘤细胞的恶性转变过程。研究表明,抑制Polθ活性可导致同源重组(homologous recombination,HR)缺陷的肿瘤细胞发生合成致死(synthetic lethality,SL)。因此,已经开发出多种针对Polθ的小分子抑制剂,可与其他化疗药物联合使用以抑制恶性肿瘤的发展。此外,敲除或抑制Polθ活性还能增加HR修复效率,从而提高外源基因靶向整合效果。本文综述了Polθ及其介导的Alt-EJ修复机制在生物学功能方面的最新研究进展,为靶向Polθ在肿瘤治疗和基因编辑方面的应用提供理论基础。

香辛料SYBR GREENⅠ染料实时聚合酶链式反应检测方法的建立及应用

目的:本研究致力于建立香辛料真实性成分的分子鉴定方法,为香辛料的掺假提供有效的鉴定和检测方法,在不同的使用条件下分别实现定性或半定量分析,为建立相关标准提供一定的基础技术支撑。方法:研究采用SYBR GREENⅠ染料实时聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法,通过设计特异性引物成功建立了特异性检测八角、茴香、胡椒和花椒的分析技术。结果:该方法能够特异性检测出八角、茴香、胡椒、花椒,Ct值在标准品体积分数0.001%~10%范围内线性关系良好。针对八角标准品,检测限为1%;针对茴香、花椒、胡椒标准品,最检测限均为0.001%。利用该方法对5份实际样本进行检测,分别在样本1中未检测出八角、茴香、胡椒、花椒;样本2、3、5中检测出八角、茴香、胡椒;样本4中检测出八角、茴香、胡椒、花椒。结论:本实验建立的SYBR GREENⅠ染料实时PCR方法灵敏度高、重复性好,可应用于实际样品的检测。

DNA聚合酶η小分子抑制剂筛选

DNA损伤修复以及基因组稳定性维持对于动植物正常生长和防御逆境至关重要。针对DNA聚合酶错误掺入导致的基因组不稳定性,本研究以DNA聚合酶η为研究对象,通过计算分子模拟对接的方式,对其可能的小分子抑制剂进行筛选,并对其酶动力学参数进行测定。结果显示:脱氧腺苷三磷酸(deoxyadenosine triphosphate,d ATP)对DNA聚合酶η的活性具有抑制效果,使其延伸的相对效率为36%~42%。分子模拟对接和体外实验结果表明,相较于dATP(亲和力为-26.7 kJ/mol),环鸟苷酸-腺苷酸(cyclic GMP-AMP,cGAMP)与DNA聚合酶η具有更低的结合能(亲和力为-35.1 kJ/mol)。酶动力学参数测定结果也表明,相较于dATP,cGAMP具有更强的抑制能力且在浓度为0.5 mmol/L时达到最强(相对延伸效率为13%)。因此,本研究筛选获得了针对DNA聚合酶η的一种潜在的小分子抑制剂。同时,鉴于该蛋白质高表达导致细胞对抗肿瘤药物(DNA损伤剂)的耐受性,这为新型药物的开发提供了依据。

SYBR GreenⅠ染料-实时荧光定量聚合酶链式反应法检测发酵乳中的霉菌和酵母含量

目的建立一种应用SYBR GreenⅠ染料的实时荧光定量聚合酶链式反应法快速检测发酵乳中的霉菌和酵母菌。方法本研究针对霉菌与酵母菌的保守序列设计引物,确定最优反应体系与反应条件。通过熔解曲线以及非目标菌株的检测验证该方法的特异性;通过菌悬液的梯度稀释检测确定该方法的灵敏度;通过菌悬液与发酵乳样品混合后进行检测,确定该方法的检出限,并得到标准曲线。结果该方法能够特异性的检测发酵乳中的霉菌、酵母菌,无交叉反应。该方法检测霉菌、酵母菌的灵敏度均为10^(2) CFU/mL,并且当菌悬液与发酵乳样品混合后,并没有降低该方法的检出限。在10^(2)~10^(6) CFU/mL浓度范围内,菌液浓度的对数值与循环阈值(cyclethreshold,Ct)具有良好的线性关系,可以在市售样品的检测中通过Ct值计算样品中目标菌的含量,更快的判断发酵乳是否被霉菌、酵母菌污染。结论该方法可用于发酵乳中霉菌和酵母菌的快速检测,为发酵乳的食品安全提供了技术保障。

DNA聚合酶θ的合成致死作用研究

利用合成致死(SL)作用治疗癌症可能会成为一种有效且对患者安全的方案。在诱导合成致死效应的众多因素中,参与DNA修复的因素是最密切相关的。当一个经典的DNA双链断裂(DSB)修复途径发生突变时,替代途径可能是消除肿瘤细胞的靶标。目前,抑制缺乏经典修复途径肿瘤细胞中的RAD52和/或PARP1一直是诱导合成致死作用的潜在靶标,但是,常用的PARP1抑制剂(PARPi)的耐药性是制定治疗方案的最大障碍。由POLQ基因编码的DNA聚合酶θ(Polθ)介导的末端连接(TMEJ)在另一种DSB修复途径起关键作用。因此,它是治疗具有同源重组修复(HRR)缺陷肿瘤的潜在靶点,抑制其活性可以诱导SL。在本综述中,主要讨论了基于靶点Polθ合成致死性的抗癌疗法的现状。

常用限制性内切酶和DNA聚合酶的规范编排

一、限制性内切酶限制酶的命名,1973年由Smith和Nathans提出:用属名的头1个字母和种名的头2个字母,组成3个字母的略语,表示寄主菌的物种名称;如有菌株名,再加上一个字母,即第4个字母表示菌株;1种特殊的菌株,具有几个不同的限制与修饰体系,则以罗马数字表示在该菌株中发现某种酶的先后次序。例如:Eco R I,第1个大写字母E为大肠杆菌Escherichia coli的属名的第1个字母;第2、3两个小写字母co为其种名的2个字母;第4个字母大写R表示所用大肠杆菌的菌株编号。再如,流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)用Hin表示。例如,从流感嗜血杆菌d株(Haemophilus influenzad d)中先后分离到3种限制酶,则分别命名为Hin d I、Hin dⅡ和Hin dⅢ。

双重荧光逆转录-聚合酶链式反应与荧光逆转录-重组酶介导等温扩增快速检测食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒

目的建立双重荧光逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)与荧光逆转录-重组酶介导等温扩增(reverse transcription recombinase-aided amplification,RT-RAA)快速有效地检测食品中食源性GⅠ型和GⅡ型诺如病毒的方法。方法根据GⅠ型、GⅡ型诺如病毒基因组保守序列设计引探,经过一系列引探浓度筛选,建立了双重荧光RT-PCR和恒温荧光RT-RAA两种检测方法,分别从敏感性、特异性、稳定性、重复性等方面进行了比较研究;同时将这两种方法应用于实际临床样本检测中,并与GB4789.42—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验诺如病毒检验》进行比对验证。结果建立的两种方法特异性良好,敏感性均可达10 copies/μL;双重荧光RT-PCR方法质粒梯度变异系数(coefficient of variation,CV)值在0.1%~1.5%区间,恒温荧光RT-RAA方法CV值在1.0%~10.0%区间,稳定性和重复性显示双重荧光RT-PCR优于恒温荧光RT-RAA检测方法;31份诺如病毒阳性食品核酸样本均能检出,且50份食品盲样检测结果与国标一致。结论本研究成功建立了双重荧光RT-PCR与恒温荧光RT-RAA快速检测食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒方法,两种方法各有优缺点,双重荧光RT-PCR稳定性和重复性好,恒温荧光RT-RAA检测时间短,仅20 min就能完成扩增,可根据不同需求选择一种或两种作为食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒的检测方法。

Pfu-sso7d DNA聚合酶的制备及反应缓冲液的研究

目的:制备有高效扩增长片段以及复杂片段能力的Pfu DNA聚合酶。方法:运用基因工程学方法构建重组质粒pET-28a-Pfu-sso7d,采用优化后的诱导条件对pET-28a-Pfu-sso7d实行诱导表达,将菌液超声破碎并提取上清液,应用镍亲和层析洗脱纯化取得较纯Pfu-sso7d DNA聚合酶。采用qPCR方法对酶进行酶活力单位定量、确定反应缓冲液组分最佳浓度及检测自制Pfu-sso7d DNA聚合酶酶活性。结果:在1 mmol·L^(-1) IPTG、16℃条件下诱导Pfu-sso7d DNA聚合酶菌液16 h,Pfu-sso7d DNA聚合酶高效表达;用20~100 mmol·L^(-1)咪唑可将蛋白洗脱。Pfu-sso7d DNA聚合酶最终活力单位定量为1 U·μL^(-1)。PCR最佳反应缓冲液为pH9.0、20 mmol·L^(-1) Tris-HCl、0.6 mmol·L^(-1) MgSO_(4)、50 mmol·L^(-1) KCl、5 mmol·L^(-1)(NH_(4))_(2)SO_(4)、0.1%Triton X-100,添加剂组分为3%DMSO、1 mol·L^(-1)甜菜碱。Pfu-sso7d DNA聚合酶能高效扩增3000 bp的目的条带,活性达到商用高保真DNA聚合酶水平。结论:基于基因重组制备的Pfu-sso7d DNA聚合酶可进行高效的PCR反应,节省了实验室PCR成本,为进一步提高Pfu DNA聚合酶活性提供一定技术参考。

猫疱疹病毒Ⅰ型荧光定量聚合酶链式反应检测方法的建立

研究旨在建立实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR)检测猫疱疹病毒Ⅰ型(Feline herpesvirus type Ⅰ,FHV-1)的方法,用于检测临床上猫的上呼吸道传染病样本。据GenBank已发表的猫疱疹病毒的gE基因序列的保守区域设计并合成一对特异性引物及探针,建立FHV-1的实时荧光定量PCR检测方法,对此方法进行特异性、灵敏度及重复性的验证,并对广东佛山某流浪猫基地猫疱疹病毒的流行情况进行调查,即对该基地的94份临床样品进行检测。结果表明:研究成功建立了FHV-1实时荧光定量聚合酶链式反应检测方法,此方法特异性强,与大多流行的犬猫病毒均未出现交叉反应;敏感性高,最低检出限为10 copies·μL^(-1);重复性好,批内变异系数为0.29%~0.71%,批间变异系数为0.88%~1.38%。应用此方法在94份临床样品中检出28份FHV-1核酸阳性样品。综上所述,研究建立的FHV-1荧光定量聚合酶链式反应方法具有较好的特异性、敏感性和重复性,为临床上FHV-1的快速检测提供了可行的解决方案。

Taq plusⅠ DNA聚合酶的反转录活性

选择具有高保真性的Taq plusⅠ DNA聚合酶,以小鼠表皮生长因子mRNA为模板研究其反转录性能。对cD-NA的检验结果表明,Taq plusⅠ DNA聚合酶在72℃下有良好的反转录活性,且由于其高保真性,故在进行反转录时既可避免碱基错配,又可避免在低温下用AMV反转录酶或Mulv反转录酶进行反转录时可能造成的cDNA序列缺失。

聚ADP-核糖聚合酶-1在喉鳞状细胞癌细胞DNA氧化损伤及凋亡中的作用

目的探究聚ADP-核糖聚合酶-1(PARP1)在喉鳞状细胞癌(LSCC)中的表达及其对LSCC细胞DNA氧化损伤与凋亡的影响。方法收集40例患者的LSCC组织及癌旁组织样本,采用免疫组化染色和qRT-PCR检测LSCC组织与癌旁组织中PARP1的表达。采用不同浓度Menadione诱导LSCC细胞系Hep-2,MTT法检测不同浓度诱导下细胞增殖抑制率。将Hep-2细胞随机分为对照组(正常培养)、Men组(20μmol/L Menadione处理)、Men+PARP1抑制剂组(20μmol/L Menadione+10μmol/L PARP1抑制剂Olaparib共处理)。MTT法计算各组细胞增殖抑制率;流式细胞术检测各组细胞内活性氧(ROS)水平;细胞免疫荧光染色观察各组细胞DNA损伤标记分子γ-H2AX焦点生成情况;Western blot测定各组细胞γ-H2AX、DNA-PKcs、BRCA1、LIG4、Caspase-3及Caspase-9蛋白表达;Hoechst33258染色观察各组细胞凋亡情况。结果LSCC组织中PARP1阳性表达率及PARP1 mRNA表达均明显高于癌旁组织(P<0.01)。Hep-2细胞经不同浓度Menadione诱导后,细胞增殖抑制率均升高(P<0.05)。与对照组比较,Men组和Men+PARP1抑制剂组的细胞增殖抑制率升高,细胞ROS水平升高,γ-H2AX焦点形成明显增加,γ-H2AX蛋白表达上调,DNA-PKcs、BRCA1、LIG4蛋白表达均下调,细胞出现浓缩、碎裂的蓝色凋亡体,Caspase-3和Caspase-9蛋白表达上调,差异均有统计学意义(P<0.05),且Men+PARP1抑制剂组以上变化较Men组更明显(P<0.05)。结论PARP1在LSCC组织中高表达,抑制其表达能够进一步加重Menadione诱导的Hep-2细胞DNA氧化损伤,并促进细胞凋亡。

重组大肠杆菌生产TaqDNA聚合酶发酵工艺优化

Taq DNA聚合酶是PCR技术中广泛应用的耐热酶。为提高重组大肠杆菌生产Taq DNA聚合酶的产量,以Taq DNA聚合酶产量和酶的比活力为考察指标,通过单因素实验优化产生TaqDNA聚合酶含量的单因素:发酵温度、pH值、IPTG诱导剂用量、诱导时间、接种量,结果表明:发酵温度、pH值、IPTG诱导剂浓度,对该基因工程菌发酵产Taq DNA聚合酶的比酶活力有显著影响,而诱导培养时间、接种量对产Taq DNA聚合酶的比酶活力影响不显著。故选择发酵温度、pH值、IPTG诱导剂浓度作为响应面的三个因素优化重组大肠杆菌生产Taq DNA聚合酶发酵工艺,响应面分析结果显示对酶的比活力显著性顺序为:IPTG诱导剂浓度>发酵温度>pH值,最佳发酵工艺参数为:发酵温度37.2℃,pH值为7.5,IPTG诱导剂浓度为0.800 mmol/L,在此条件下发酵,Taq DNA聚合酶比活力达到(43.822±0.878)kU/mg。

抗癌Ⅰ号对小鼠U_(14)腹水癌细胞及其DNA聚合酶α活性的影响

抗癌Ⅰ号对U14 具有较高的小鼠抑瘤率 ,应用DNA聚合酶活性测定技术表明抗癌Ⅰ号能使U14 腹水癌细胞DNA聚合酶α活性降低。

DNA聚合酶Ⅰ的功能与结构的发现

本文具体介绍了DNA聚合酶Ⅰ的功能与结构的发现过程,包括聚合酶活性中心模型的提出;聚合酶分子量的测定;聚合酶的分离及其活性片段的获得;聚合酶Klenow片段晶体结构的测定以及DNA结合部位与活性位点的确立;Klenow片段结合DNA的晶体结构以及噬菌体T7DNA复制的晶体结构的测定,在测定这些复合物共晶体的基础上,提出了DNA与聚合酶结合的右手模型。

HBV DNA聚合酶在介导HBV相关肝细胞癌肿瘤细胞免疫逃逸中的作用

目的本研究旨在明确HBV DNA聚合酶是否与T淋巴细胞功能衰竭相关,进而介导HBV相关肝细胞癌(HCC)肿瘤细胞的免疫逃逸以及探寻具体的分子机制。方法稳定转染带有Flag标签的HBV DNA聚合酶表达质粒(FlagHBV-P)和细胞间黏附分子-1(ICAM1)的肝癌细胞系Huh7、HepG2与Jurkat细胞共培养,MTT、qRT-PCR、酶联免疫吸附测定(ELISA)实验分别检测Jurkat细胞增殖、活化(CD69表达)以及细胞因子IFN-γ分泌情况。RNA-seq筛选稳转细胞系与对照细胞中表达差异的免疫相关分子,mRNA半衰期及蛋白半衰期实验确定HBV DNA聚合酶对免疫相关分子具体在何种水平产生影响。网站预测此免疫相关分子启动子区域可能结合的转录因子,Western Blot实验验证转录因子对免疫相关分子的影响,挽救实验确定HBV DNA聚合酶是否通过此转录因子影响免疫相关分子的表达水平。两组间比较采用成组t检验。结果与对照组相比,实验组细胞(Huh7、HepG2)增殖、活化及细胞因子分泌明显降低(P值均<0.01)。与对照细胞相比,实验组细胞(Huh7、Hep G2)的ICAM1 mRNA和蛋白水平均降低(P值均<0.01)。网站预测ICAM1启动子并初步筛选锚定了NFKB1、RELA和STAT3。与对照组相比,实验组细胞(Huh7、Hep G2)p65蛋白的表达水平明显降低(P值均<0.01)。过表达p65后,ICAM1蛋白表达水平明显升高,降表达p65后,ICAM1蛋白表达水平明显降低(P值均<0.01),挽救实验中过表达p65后,对照组与实验组细胞的ICAM1表达水平无明显差异(P值均>0.05)。过表达ICAM1后,对照组与实验组细胞(Huh7、Hep G2)的增殖、活化及细胞因子分泌无明显差异(P值均>0.05)。结论HBV DNA聚合酶通过抑制NF-κB中p65的表达来下调ICAM1的水平以介导HCC免疫逃逸。

基于磁性层状双氢氧化物和核酸外切酶Ⅰ的新型大肠杆菌荧光传感器构建

目的基于磁性层状双氢氧化物(magnetic layered double hydroxide,MLDH)对修饰在单链和双链DNA上的羧基荧光素(6-car-boxyfluorescein,FAM)的高效淬灭,以及核酸外切酶Ⅰ(exonucleaseⅠ,ExoⅠ)对单链DNA的选择性降解作用,建立测定大肠杆菌的荧光传感器。方法将不同浓度的大肠杆菌特征DNA与FAM标记的互补DNA探针杂交,形成FAM-双链DNA,加入Exo I选择性降解剩余探针,再加入MLDH吸附并淬灭FAM-双链DNA。通过磁铁分离上清液与MLDH,测量上清液的荧光强度。结果在最优实验条件下,本法检测大肠杆菌特征DNA的线性范围为0.05~30nmol/L,相关系数(R^(2))为0.997,检测限(3σ)为0.025nmol/L,对江水、自来水和茶饮料中大肠杆菌DNA的回收率为85.4%~118%,相对标准偏差小于5%。结论利用MLDH的荧光淬灭能力和Exo I对单链DNA的选择性水解能力成功构建了测定大肠杆菌的新型荧光传感器,与传统大肠杆菌检测法相比,所建新型传感器灵敏度高、选择性好、准确度高,能实现对大肠杆菌的快速检测。

常用限制性内切酶和DNA聚合酶的规范编排

一、限制性内切酶限制酶的命名,1973年由Smith和Nathans提出:用属名的头1个字母和种名的头2个字母,组成3个字母的略语,表示寄主菌的物种名称;如有菌株名,再加上一个字母,即第4个字母表示菌株;1种特殊的菌株,具有几个不同的限制与修饰体系,则以罗马数字表示在该菌株中发现某种酶的先后次序。

常用限制性内切酶和DNA聚合酶的规范编排

一、限制性内切酶限制酶的命名,1973年由Smith和Nathans提出:用属名的头1个字母和种名的头2个字母,组成3个字母的略语,表示寄主菌的物种名称;如有菌株名,再加上一个字母,即第4个字母表示菌株;1种特殊的菌株,具有几个不同的限制与修饰体系,则以罗马数字表示在该菌株中发现某种酶的先后次序。例如:Eco R I,第1个大写字母E为大肠杆菌Escherichia coli的属名的第1个字母;第2、3两个小写字母co为其种名的2个字母;第4个字母大写R表示所用大肠杆菌的菌株编号。再如,流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)用Hin表示。例如,从流感嗜血杆菌d株(Haemophilus influenzad d)中先后分离到3种限制酶,则分别命名为Hin d I、Hin dⅡ和Hin dⅢ。