山羊PMEL基因启动子活性及转录调控元件分析

旨在筛选调控山羊毛色基因PMEL的启动子活性区域及转录因子,为探究该基因的表达调控机制提供理论依据,并为彩色山羊的育种和改良提供思路。以山羊基因组DNA为模板,PCR扩增PMEL基因不同长度的启动子缺失片段,定向克隆至pGL3-basic载体,将重组质粒转染到293T和A375细胞,通过双荧光素酶检测系统测定相对荧光素酶活性值;利用生物信息学方法对PMEL基因核心启动子区的转录因子结合位点进行预测,随后利用重叠延伸PCR分别对pGL3-327质粒上预测的转录因子结合位点进行点突变并构建突变载体,利用双荧光素酶检测系统进行活性验证。结果显示,本研究成功构建了7个不同长度的启动子片段,其中6个片段具有明显的启动子活性。经过双荧光素酶活性检测发现山羊PMEL基因-251/+76区域为核心启动子区域。通过不同长度的启动子片段的活性比较发现,-251/-62区域的缺失造成启动子活性从最高到消失,表明该区域对山羊PMEL基因转录调控有重要影响,生物信息学分析发现该区域存在5个转录因子结合位点,利用点突变构建了5个突变载体,经过双荧光素酶检测发现5个突变载体的活性均显著下降。提示这5个转录因子是山羊PMEL基因转录的正调控元件。本研究确定了山羊PMEL基因启动子核心区域为-251/+76,NF-1(-206/-197)、Sp1(-186/-174)、Sp1(-151/-139)、CREB(-91/-82)和Sp1(-82/-71)结合位点为山羊PMEL基因转录的正调控元件。

狐狸PMEL基因密码子使用特性分析

前黑素小体蛋白(PMEL)对狐狸毛色中黑色素的合成和沉积过程有重要的调控作用。利用Codon W软件和系统聚类分析法等分析狐狸及14种哺乳动物PMEL基因的密码子偏性,为研究PMEL基因蛋白质表达机制提供理论依据。结果表明,狐狸PMEL基因偏好使用的密码子有34个,以G/C结尾密码子的同义密码子相对使用度明显偏高。该基因编码亮氨酸、缬氨酸的2个最优密码子分别为CTG、GTG。狐狸PMEL基因在密码子偏好的使用上与家猫、猎豹相似,但与同源性极高的家犬不同。基于同义密码子相对使用度的系统聚类分析结果表明,家猫和狐狸均为一类,在密码子使用上最为相似。为研究PMEL基因的表达机制及目的蛋白表达水平的提高提供了理论依据。

IKZF4和PMEL基因CNV与白癜风的关联性研究

目的探讨IKZF4和PMEL基因CNV与白癜风发病的关联性。方法收集1 101例患者和1 101例健康对照,设计探针,采用TaqMan Real-time PCR系统进行基因拷贝数多态性分析,SDS 2.4软件输出IKZF4与PMEL基因拷贝数,并运用SPSS 19.0进行数据整理和结果的统计分析。结果①携带有IKZF4基因拷贝数为2和>2的个体增加白癜风的发病风险(P=0.03,OR=1.30,95%CI:1.07~1.57;P=0.04,OR=1.31,95%CI:1.00~1.71),携带有IKZF4基因拷贝数<2的个体降低白癜风的发病风险(P=3.90×10-6,OR=0.53,95%CI:0.41~0.67);②携带有PMEL基因拷贝数为2的个体增加白癜风的发病风险(P=1.03×10-7,OR=3.03,95%CI:2.05~4.57),携带有PMEL基因拷贝数<2的个体降低白癜风的发病风险(P=4.69×10-8,OR=0.23,95%CI:0.13~0.38)。③携带有IKZF4和PMEL基因拷贝数>2的患者明显增加白癜风合并自身免疫性疾病的风险(P=3.49×10-4,OR=2.38,95%CI:1.47~3.76;P=0.006,OR=4.06,95%CI:1.38~10.77),但IKZF4和PMEL基因拷贝数与白癜风其他的临床亚表型无明显相关性(P>0.05)。结论IKZF4和PMEL基因CNV与白癜风的易感性相关,且二者的CNV可能影响其疾病表型(白癜风伴发其他自身免疫性疾病),但与白癜风的某些亚型(如发病年龄、性别、皮损面积、临床类型、家族史、同形反应等)无明显相关性。

北极蓝狐和北极白狐PMEL基因不同组织差异的表达

为了确定PMEL基因在北极蓝狐和北极白狐不同组织中的表达特征,进而确定其与毛色形成的相关性,以北极蓝狐和北极白狐为试验对象,利用实时荧光定量PCR技术构建了前黑素小体蛋白基因(PMEL)在北极蓝狐和北极白狐的组织表达谱,并比较分析了该基因在以上2种不同毛色北极狐皮肤中mRNA的表达差异。结果表明,PMEL基因在北极蓝狐和北极白狐的不同组织(皮肤、心、肝、脾、肺、肾和肌肉)中均有表达,但在皮肤中的表达量均为最高,且北极蓝狐mRNA表达显著高于北极白狐(P<0.05),提示PMEL基因的表达与北极狐深色毛色的形成呈正相关。

坝上长尾鸡pmel基因核心启动子的鉴定

为探明坝上长尾鸡的前黑素小体蛋白(Pre-melanosomal protein,Pmel)基因核心启动子区,首先构建了双荧光素酶表达载体,通过脂质体瞬时转染鸡胚成纤维细胞DF1,并利用双荧光素酶检测试剂盒进行启动活性检测。成功克隆了坝上长尾鸡pmel基因5?侧翼区片段1268bp,预测启动子区(-1200–+68)含有2个CpG岛和多种转录因子结合位点,构建了9个含有不同长度pmel基因启动子片段的表达载体及1个核心启动子区突变载体,说明鸡pmel基因启动子的核心区域为-840–+68bp,其中-840–-590bp和-525–-266bp区域为正调控区,-590–-525bp区域为负调控区,多态位点(-456、-435、-410、-374和-341)对pmel基因启动子活性有较大影响。

鸭PMEL17基因多态性与羽色性状相关性研究

为了探讨PMEL17基因对鸭羽色遗传性状的影响,试验以樱桃谷鸭(父本)和凤头白羽鸭(母本)的杂交F1代个体为样本,对PMEL17基因外显子进行PCR扩增并直接测序,利用生物信息学软件进行多态性分析,并与羽色进行关联。结果表明:在PMEL17基因编码区发现5个多态位点1904(C/G)、1961(T/C)、2102(C/T)、2110(G/A)和2143(A/G)的碱基突变引起了氨基酸的变化。群体遗传学分析显示,1904(C/G)、2102(C/T)、2110(G/A)和2143(A/G)位点表现为中度多态(0.25<PIC<0.5),1961(T/C)位点表现为低度多态(PIC<0.25)。χ~2检验表明鸭F1代群体在1904(C/G)、1961(T/C)、2102(C/T)、2110(G/A)和2143(A/G)位点均达到Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。关联分析表明,PMEL17基因1904(C/G)、1961(T/C)和2143(A/G)位点基因型分布与鸭羽色具有显著或极显著差异(P<0.05或P<0.01),由此推测PMEL17基因与鸭羽色性状具有一定的关联性。研究结果为后期的育种工作提供了一定的理论基础。

莆田黑鸭PMEL17基因的克隆、组织表达与多态性分析

为研究莆田黑鸭前黑素小体蛋白(PMEL17)基因序列特征,分析其在不同羽色鸭毛囊及莆田黑鸭不同组织中的表达情况,以莆田黑鸭毛囊组织为材料,利用cDNA克隆技术获得PEML17基因编码区全长序列并进行生物信息学分析;利用荧光定量PCR技术检测PMEL17基因在毛囊、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肌胃、肾脏、大脑、胸肌、腿肌和皮肤组织中的表达情况。结果表明,莆田黑鸭PMEL17基因编码区全长1917 bp,其同源性与鸡最近,与其它物种变异性较大;PMEL17基因编码638个氨基酸,二级结构以无规则卷曲和延伸链为主,预测为稳定的疏水性蛋白,存在1个跨膜区;PMEL17基因在黑羽毛囊中表达,在白羽毛囊中不表达,莆田黑鸭各组织中仅在毛囊和皮肤表达,其它组织几乎不表达;在第6外显子处发现2个SNP位点,导致天冬氨酸突变成丙氨酸。试验结果为进一步研究PMEL17基因在鸭羽色形成中的作用奠定基础,也为莆田黑鸭种质特性研究提供数据。