PMI/甘露糖筛选体系在植物转基因中的应用

介绍了一种可在植物转基因中应用的新型筛选方法———磷酸甘露糖异构酶(PMI)法,与传统筛选体系不同,它以甘露糖为筛选剂对转化细胞进行正筛选。PMI能将甘露糖- 6 -磷酸转化成果糖- 6 -磷酸,使转化细胞以甘露糖为唯一或主要碳源而正常生长;非转化细胞由于不能利用甘露糖而停止生长。该筛选体系受基因型、培养基中其他糖和磷酸根离子浓度及培养条件等因素的影响。目前已应用于多种模式植物和经济作物的转基因筛选,在木本植物甜橙上也首获成功。其检测方法多样,除了常规转基因检测方法外,还可对酶活性进行检测,其中氯酚红法简单可靠,且无需昂贵试剂。安全评估结果表明PMI基因对人体健康和环境无害。PMI/甘露糖筛选体系有望成为植物转基因的又一有效筛选手段。

利用pmi标记基因筛选培育转EaDREB2B基因甘蔗

利用已构建的植物表达载体prd29a-dreb-hyg,通过酶切连接到含有磷酸甘露糖异构酶基因(pmi)的表达质粒pZMLR14上,构建植物表达载体pDREB-PMI。利用基因枪轰击转化甘蔗愈伤,经过甘露糖筛选,共获51株抗性苗,转化再生频率为4.25%。对转基因植株进行分子检测,结果表明有8株为阳性转基因无性系。氯酚红试验表明标记磷酸甘露糖异构酶基因在转基因株系中均有表达。对转基因T_1代甘蔗植株进行分子检测,结果表明EaDREB2B基因在转基因甘蔗无性系T_1代中稳定遗传。该结果为进一步研究EaDREB2B基因在甘蔗抗旱方面的作用奠定了基础。

PMI基因为筛选标记的抗旱表达载体构建

利用PCR克隆了大肠杆菌(Escherichia coli.)6-磷酸甘露糖异构酶(pmi)并进行了序列测定,序列分析表明,该片段与已经报道同源性为98.9%,推导的氨基酸序列与报道的同源性为100%。将该基因替换植物表达载体pCAMBIA130l中的潮霉素抗性基因,成功构建了以pmi为选择标记基因的植物表达载体pCAMBIA1301DP,为抗旱转基因育种奠定了物质基础。

甘蔗转基因甘露糖筛选系统的建立

以甘露糖作为筛选底物,对甘蔗品种新台糖22号进行临界筛选浓度测定,获得愈伤组织的继代、分化、生根的临界筛选浓度。而后应用含有甘露糖筛选标记基因pmi及绿色荧光蛋白报告基因GFP的植物表达载体,通过农杆菌介导法对新台糖22号的愈伤组织进行遗传转化。用所测定的临界筛选浓度先后进行继代、分化、生根筛选培养,获得抗性植株。对获得的抗性植株分别进行pmi基因和GFP基因的PCR检测,以及GFP显微镜荧光检测,结果证实已成功建立了高效的甘蔗转基因甘露糖筛选系统。

基因枪介导的转Vp-1基因小麦的获得及检测

为了探究源于玉米的抗穗发芽基因Vp-1改良小麦(Triticum aestivum L.)抗穗发芽性状的可行性,以pmi及bar为筛选标记基因,通过基因枪介导法将Vp-1基因导入小麦栽培品种郑麦9023幼胚愈伤组织中,用甘露糖和双丙氨磷(Bialaphos)2种不同的筛选剂筛选得到抗性植株并对其进行PCR鉴定。结果显示,通过pmi/甘露糖筛选体系得到53株抗性植株,其中5株为转基因小麦植株,转化率为0.29%;通过bar/Bialaphos筛选体系得到152株抗性植株,其中11株为转基因小麦植株,转化率为0.78%。

昆虫学证据在死亡时间推断中的应用

法医昆虫学是一门既古老又新兴的交叉学科,死亡时间(PMI)推断是法医昆虫学最主要的实践应用之一。为阐明昆虫学证据在PMI推断中的应用以及未来该领域研究的热点和难点,本文在阐述昆虫个体发育、昆虫群落演替、昆虫代谢物质以及时序基因等相关概念的基础上,对近年来国内外在利用法医昆虫学进行PMI推断领域的研究进展进行了综述。此外,本文还总结了实践中需要注意的问题如各种推断方法的适用范围、常见的误区以及在现场中昆虫学证据的采集技巧等,以期提高基层法医工作者的昆虫学证据采集有效性。

甘露糖正向筛选体系的建立及在拟南芥遗传转化中的应用

为了研究甘露糖正向筛选体系在拟南芥转化中的有效性,本研究参照GenBank上公布的PMI基因序列,通过PCR从大肠杆菌克隆了6-磷酸甘露糖异构酶(6-phosphomannose isomerase,PMI)基因,替换植物表达载体pCAMBIA1301中的潮霉素磷酸转移酶(hygromycin phosphotransferase,HPT)基因,并将以CaMV35S和AmCBL1P两种启动子调控的沙冬青AmCBL1基因成功地构建到重组载体pPMI上,并导入根癌农杆菌E-HA105中,然后通过农杆菌花序浸染法转入拟南芥。将获得的阳性植株通过GUS组织化学法鉴定、氯酚红(chlorophenol red,CPR)法及PCR检测,证明PMI基因已经转入拟南芥中。在不使用抗生素和除草剂的情况下这种筛选体系为转基因拟南芥筛选提供了更加安全有效的方法,并且为以后AmCBL1基因的功能验证及植物抗逆性的改良奠定了基础。

磷酸甘露糖异构酶基因的克隆与表达载体的构建

根据genebank中公布的pmi基因序列通过PCR的方法从大肠杆菌中得到目的片断,并与pGM-T easy载体连接。将鉴定为阳性重组子中的目的基因进一步与植物表达载体pBI121的不同区域连接,成功构建了载体NPTII-pmi-121和pmi-121△NPTII。

SD大鼠死后心血中大肠杆菌DNA含量与早期死亡时间相关性的研究

目的探讨SD大鼠死后心血总DNA含量变化规律;研究大鼠死后心血中大肠杆菌β-D-半乳糖苷酶基因(Lac Z基因)含量变化与PMI的相关性。方法用分光光度计检测SD大鼠死后96h内心血总DNA浓度变化;选择大肠杆菌LacZ基因上一段较为保守的序列,构建引物及探针,制备重组质粒标准品,利用qPCR技术检测大鼠死后96 h内心血中大肠杆菌LacZ基因浓度变化情况。结果随着PMI的延长,SD大鼠死后96h内心血DNA浓度呈线性增长趋势,其回归方程为:y=1.0233x+31.647,R^2=0.9345;大鼠死后0~48h LacZ基因扩增不明显,死后60~96h LacZ基因浓度呈指数式增长,其回归方程为:y=3E-06e^(0.1567x),R^2=0.9569。结论 SD大鼠死后96h内的心血总DNA含量变化及大肠杆菌LacZ基因含量变化均可用于推断PMI。

骨骼肌circRNA在死亡时间推断中的初步筛选及验证研究

目的通过构建骨骼肌中环状RNA(circular RNA,circRNA)表达谱,筛选出人体骨骼肌中与死亡时间具有时序性变化的circRNAs,并对筛选出的circRNAs进行验证,进而探讨其相对表达量与死亡时间的相关性。方法芯片实验选取2例外界温度、湿度相对一致,已知死亡时间在24 h内的个体,分别于尸检即刻(12 h以内)、3、5、7、10 d各取50 g组织进行总RNA提取,并进行逆转录、探针标记、基因芯片检测等实验,初步得到circRNA表达谱;对筛选出的circRNAs在后续收集的18例检材中进行验证,对所得数据进行统计分析。结果骨骼肌组织中共检测出13156个circRNAs,但在10 d内整体呈下降趋势的circRNAs只有hsa_circ_0001727、hsa_circ_0001136、hsa_circ_0001871、hsa_circ_0005251、hsa_circ_0000284、hsa_circ_0000520、hsa_circ_00019717个。对所筛选出的7个circRNAs在18例检材中进行验证,发现只有hsa_circ_0001727、hsa_circ_0001136、hsa_circ_0001871、hsa_circ_0005251、hsa_circ_00002845个circRNAs随着死亡时间增加,其相对表达量显著下降,具有统计学意义(P<0.05)。而hsa_circ_0000520、hsa_circ_00019712个circRNAs的表达为阴性。结论circRNA是一种较为稳定的生物标记物,部分可用于死亡时间推断的研究。

大鼠死后管家基因mRNA稳定性及其时序性降解与PMI相关性研究

目的研究脑组织及骨骼肌内β-actin、GAPDH、RPL32、PKG1、SDHA、RPL13、HPRT、TBP、YWHAZ死后稳定性及其相对表达量与死亡时间(PMI)的相关性。方法取健康成年SD大鼠33只,依据据死亡时间不同随机分为11组(0h、1h、3h、6h、12h、24h、2d、4d、8d、16d、24d),分别在各时间点取大鼠胫骨前肌及脑组织约50mg,提取各组织总RNA,利用RT-q PCR技术检测9种管家基因的m RNA相对表达量。运用ge Norm、Norm Finder和Best Keeper软件对基因稳定性进行评价,利用spss软件对内参标准化的m RNA指标进行回归分析。结果脑组织及骨骼肌中均为HPRT稳定性最高,适合用于本研究的内参基因。脑组织中SDHA、RPL32及TBP 3种指标的相对表达量变化与PMI有一定的线性关系。骨骼肌中m RNA指标相对表达量与PMI之间没有显著的相关性。结论脑组织及骨骼肌是较适宜推断晚期死亡时间的检材。脑组织中SDHA、RPL32及TBP 3种m RNA的相对表达量变化与PMI有一定的线性关系,有望成为推断PMI的辅助指标。

基于埋葬大鼠的骨骼微生物群落演替规律推断死亡时间

目的 基于大鼠模型研究埋葬尸体骨骼微生物的群落演替规律,并以此推断死亡时间(PMI),为埋尸案件的死亡时间推断提供参考。方法 将20只大鼠埋葬于深度20 cm的土壤中,分别于5个时间点(7 d、14 d、30 d、45 d、60 d)采集上肢肱骨及下肢股骨,对细菌16S rRNA基因测序及数据分析,利用机器学习算法构建预测死亡时间的随机森林模型。结果 埋葬大鼠在60 d的分解过程中,上肢肱骨和下肢股骨微生物群落无显著差异,不同时间点微生物群落差异显著。在尸体腐败进程中,骨骼厚壁菌门、拟杆菌门相对丰度总体呈现上升趋势,变形菌门、放线菌门呈现下降趋势。利用随机森林算法筛选出与PMI相关的89个OTU作为标记物并进行预测模型的构建,其R2值可达86.32%,平均绝对误差(MAE)为2.11±1.81 d。结论 本实验基于埋葬大鼠模型所建立的骨骼微生物的死亡时间推断模型具有较好的准确性,可为埋葬案件的死亡时间推断提供参考。