绝经期后女性腹部脂肪组织芳香化酶mRNA表达的研究

目的 :研究绝经后妇女腹部皮下、大网膜脂肪组织中芳香化酶mRNA的表达水平变化。方法 :应用半定量逆转录 -聚合酶链反应 ,检测绝经后肥胖妇女及非肥胖正常妇女芳香化酶mRNA的表达 ,分析其与空腹真胰岛素水平、血糖、血脂、体质量指数、腰臀比及血压等指标的关系。结果 :绝经后肥胖妇女皮下、大网膜脂肪组织芳香化酶mRNA的表达水平高于正常体质量的绝经后妇女。绝经后女性皮下脂肪组织芳香化酶mRNA的表达水平高于大网膜脂肪组织。绝经后肥胖女性皮下、大网膜脂肪组织芳香化酶mRNA的表达与腰臀比、空腹胰岛素呈正相关。结论 :绝经后女性腹型肥胖及与肥胖相关的胰岛素抵抗与腹部脂肪组织内芳香化酶mRNA表达水平有关。

459例女性健康体检者HPV基因型及高危因素分析

目的研究459例女性健康体检者宫颈人乳头瘤病毒(HPV)感染情况、基因型别分布及其高危因素。方法采用巢式PCR和焦磷酸测序技术检测459例受检者宫颈脱落细胞中HPV分型情况,同时收集受检者一般资料、月经婚育史、生殖道疾病既往史,分析HPV感染的相关危险因素。结果 HPV阳性检出率为17.9%,共检测出7种高危基因型别,其中HPV16检出率最高(9.8%),其次是HPV58(7.0%),HPV18(5.2%)。单纯感染、双重感染、多重感染的检出率分别是9.6%、4.8%、1.5%。饮酒、经济收入<3 000元/月、性伴侣>1个、性生活频率>4次/月、伴有宫颈糜烂是HPV感染的危险因素(P<0.05)。结论 HPV DNA基因型别检测可为宫颈癌的早期筛查和HPV疫苗的研发使用提供重要信息,为高危人群的早预防、早诊断、早治疗提供重要依据。

应用聚合酶链式反应方法检测携带大麦黄矮病毒的单头蚜虫

应用聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)扩增病毒的cDNA,可以快速、灵敏、专化地检测单头介体蚜虫所携带的大麦黄矮病毒。测定时间可以短至6小时,测定标本用量可以少至1/20头蚜虫,无毒蚜在带毒植株上饲毒30分钟即可检出含有病毒。

儿童幽门螺杆菌感染的家庭聚集现象的研究──附60户检测结果分析

目的:探讨广西儿童幽门螺杆菌(Hp)感染的可能途径。方法:采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法分析60户家庭133例样本伴有上消化道症状的儿童及其一级亲属唾液和胃黏膜中的Hp尿素酶C(UreC)基因,比较两种限制性核酸内切酶HhaⅠ与AluⅠ酶切复合类型(RFLP-C),评价儿童获得Hp的可能途径。结果:在调查的60户中,儿童与其亲属Hp感染或非感染状态一致者占49户(82%),感染状态不一致者占11户(18%),P<0.001。从78个Hp阳性的家庭成员中共确定22个独立的Hp酶切类型。从25%(7/28)Hp阳性儿童、33%(10/30)Hp阳性亲属的唾液扩增出Hp,唾液与相应胃黏膜中的HpRFLP-C酶切类型一致。92%(67/73)胃体与胃窦Hp的RFLP-C类型一致。84%(26/31)先证者感染的Hp与其亲属感染的Hp类型相同,16%(5/31)与亲属的Hp类型不同。结论:PCR-RFLP分析HpUreC基因的酶切类型分辨率较高,扩增样本方法简便,适用于Hp的流行病学研究。Hp感染患者唾液与胃黏膜中扩增出的HpUreC基因RFLP-C酶切类型完全一致,同一家庭内感染的HpUreC基因RFLP类型高度相符,提示家庭内成员的口-口传播可能是儿童期获得Hp的重要模式。

毛细管无胶筛分电泳在苯丙氨酸羟化酶基因短串联重复序列分析及苯丙酮尿症基因诊断中的应用

目的 应用毛细管无胶筛分电泳技术分析苯丙氨酸羟化酶基因内含子 3中四核苷酸 ( TCTA)重复序列的多态性。方法 通过毛细管无胶筛分电泳分离分析特异 PCR产物。结果 在 6 1个正常中国人和 6个苯丙酮尿症家系中共检测到从 2 2 4bp到 2 6 0 bp连续分布的 1 0种等位基因片段 ,多态信息量为 0 .738。其中 2 6 0 bp等位片段是第 1次在中国人群中被检测到。用这一检测方法对 6个苯丙酮尿症家系进行基因型分析 ,并完成了 1例产前基因诊断。结论 与聚丙烯酰胺变性凝胶电泳相比 ,毛细管电泳具有准确、快速、自动化和高分辨等优点。毛细管电泳技术与 PCR技术的结合在遗传病基因诊断方面具有广泛的应用前景。

用荧光定量RT-PCR检测鼻咽癌病人外周血CK-19 mRNA的表达

【目的】探讨鼻咽癌病人外周血中CK-19 mRNA表达与鼻咽癌临床的关系。【方法】用荧光定量RT-PCR方法检测97例鼻咽癌病人及26例正常人外周血中CK-19 mRNA的表达量。【结果】鼻咽癌病人外周血中CK-19 mRNA阳性表达94％(91/97),健康对照组阳性表达8％(2/26);T4期病人及远处转移病人外周血中CK-19 mRNA拷贝数显著升高,CK-19 mRNA拷贝数与鼻咽癌临床分期呈正相关。【结论】荧光定量RT-PCR方法检测鼻咽癌病人外周血CK-19 mRNA表达,方法简单、准确,在预测鼻咽癌远处转移及准确临床分期方面有一定可行性。

基于PCR-LDR平台的近交系小鼠遗传质量快速检测方法

目的建立基于PCR-LDR平台的近交系小鼠SNP快速分型方法,用于检测实验小鼠的遗传质量与品系纯度。方法利用可移植性极高的PCR-LDR技术,以常见近交系小鼠为研究对象,选取了21条染色体上的45个SNP位点,分别设计引物和探针,经过筛选和验证,建立了多重PCR-LDR(polymerase chain reaction and ligase detection reaction,PCR-LDR)分型方案。结果四组多重PCR-LDR可实现45个SNP位点的基因分型,其中43个、44个与45个SNP在样本中的检出率分别为100%、90.9%与36.4%。所有样本经分型确定为纯合体,并得到了常见近交系小鼠SNP位点信息。结论实现了常见近交系小鼠快速、高通量的基因分型,可用于遗传质量检测和品系鉴定。

实时荧光定量聚合酶链反应技术对结核性脑膜炎的诊断价值

目的探讨实时荧光定量聚合酶链反应技术(RT-PCR)对结核性脑膜炎的诊断价值。方法分别采用涂片法、RT-PCR法对结核性脑膜炎、疑似结核性脑膜炎以及非结核性脑膜炎患者的脑脊液标本进行检测,并对检测结果进行比较分析。结果涂片法共检出10例阳性,其中结核性脑膜炎7例(70.00%),疑似结核性脑膜炎3例(30.00%);RT-PCR法共检出46例阳性,其中结核性脑膜炎31例(67.39%),疑似结核性脑膜炎15例(32.61%)。对结核性脑膜炎患者检测,涂片法阳性率(12.28%)低于RT-PCR法阳性率(54.39%),差异有统计学意义(P<0.05);对疑似结核性脑膜炎患者检测,涂片法阳性率(2.91%)低于RT-PCR法阳性率(14.56%),差异有统计学意义(P<0.05);脑脊液涂片法检测结核性脑膜炎的灵敏度为12.28%,漏诊率为87.72%,RT-PCR法检测的灵敏度为54.39%,漏诊率为45.61%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 RT-PCR法诊断结核性脑膜炎具有灵敏度好,准确度高等特点,临床有重要的指导意义。

线粒体ATPase-6基因多态性与男性精子活力的关系

目的探讨线粒体ATP合成酶6亚基(ATPase-6)基因多态性与男性精子活力的关系。方法选择弱精子症患者319例(观察组)及精子活力正常者344例(对照组),采用聚合酶链式反应—限制性片段长度多态性分析技术检测其线粒体ATPase-6基因(+9 052 bp)的HaeⅡ酶切位点多态性,并对两组的基因型分布及等位基因频率进行Hardy-Weinberg平衡检测,分析ATPase-6突变基因频率与精子活力的关系。结果观察组的hh、Hh、HH基因型分布分别为19.74%、1.25%、79.01%,对照组分别为4.94%、0.58%、94.45%,两组基因型分布均处于Hardy-Weinberg平衡范围;但观察组的突变型基因(h)频率明显高于对照组(P<0.01)。结论 ATPase-6基因(+9 052bp)HaeⅡ酶切位点突变可能影响ATPase-6基因的翻译效率,进而影响男性精子活力,引起弱精子症。

胃癌细胞PTEN甲基化与其表达的相关性

目的:探讨胃癌细胞PTEN基因启动子区域甲基化与其mRNA表达的关系.方法:采用甲基化特异性PCR法(MSP)检测四种胃癌细胞系SGC-7901(中度分化)、BGC-823(低度分化细胞)、MGC-803(低度分化细胞)、HGC-27中PTEN基因甲基化状态,RT-PCR检测四种胃癌细胞系PTEN表达水平(未分化).结果:HGC-27、MGC-803、BGC-823细胞系可检测到PTEN基因启动子的甲基化,SGC-7901细胞未检测到甲基化,甲基化水平的顺序依次为:HGC-27最高(138.217±7.898,P<0.01),MGC-803、BGC-823次之(P>0.05).PTENmRNA表达水平的依次顺序为:SGC-7901最高(0.336±0.079,P<0.01),BGC-823、MGC-803次之(P>0.05),HGC-27表达水平最低(0.113±0.047,P<0.05),其表达水平随着其启动子区甲基化水平增高而降低.PTENmRNA表达及其启动子甲基化水平还与胃癌细胞分化程度相关.结论:胃癌细胞PTEN基因启动子区域出现异常甲基化,可能是导致其mRNA表达异常的主要原因,也可能是导致胃癌发生、发展的重要机制之一.

转化生长因子β1启动子区C-509T位点基因多态性与肝纤维化关系

目的:建立多聚酶链式反应-限制性片段长度多态分析(PCR-RFLP)法检测转化生长因子β1(TGF-β1)启动子区C-509T位点的变异并探讨其在肝纤维化中的作用．方法:根据TGF-β1启动子区基因设计引物, 在C-509T位设计Bsu36 I酶切位点,根据PCR 产物酶切结果判断该位点为C或T．观察对象为慢性乙型肝炎患者50例,乙型肝炎后肝硬化患者46例．结果:测序显示本文两株纯合子与TGF-β1启动子区序列同源性在99％以上,并在C-509T 位点出现预期变异:乙型肝炎和乙型肝炎后肝硬化两组都是以CT基因型为主,但是肝硬化组CC基因型(28.3％)高于TT基因型(19．6％), 而肝炎组TT基因型(22％)高于CC基因型(4％), 几组之间有显著性差异(P<0．01)．结论:本文建立的方法可用于TGF-β1启动子区C-509T住点基因多态性的检测,该位点CC 基因型可能与肝纤维化有关．

甲基化特异性PCR技术的质量控制及改进

目的:改进甲基化特异性PCR(MSP)技术并控制实验质量.方法:采用改进的MSP法检测正常胃粘膜及胃癌组织中caveolin-1基因的甲基化状况.运用饱和酚-氯仿抽提法提取DNA,其中石蜡包埋组织连续切片厚度为8μm;采用热启动PCR:反应体系为25μL、变性温度设定为95.5℃、循环数设定为30.结果:新鲜组织较石蜡包埋组织更适于MSP实验,但福尔马林固定石蜡包埋组织同样可用于MSP实验,并且8μm厚的石蜡包埋组织能获得较完整的DNA链.热启动PCR效果良好:25μL体系敏感性优于50μL体系,95.5℃可以使含CpG岛的DNA链解链更完全,30个循环足以扩增小于150bp的目的片段.结论:采用改进的MSP技术,可获得较好的DNA模板,提高实验的灵敏度和成功率,更适于甲基化的研究.

EGFR和Annexin-Ⅰ在子宫内膜异位症异位内膜的表达及意义

目的:检测表皮生长因子受体(EGFR)和膜联蛋白-I(Annexin-Ⅰ)在子宫内膜异位症(EMT)异位内膜的表达,探讨二者表达的变化与EMT的关系。方法:选取32例EMT患者(研究组)异位内膜及在位内膜,其中轻度组(Ⅰ、Ⅱ期)16例(增殖期8例,分泌期8例),重度组(Ⅲ、Ⅳ期)16例(增殖期8例,分泌期8例)。同时获取16例非EMT患者的子宫内膜标本作为对照组(增殖期8例,分泌期8例)。采用实时荧光定量PCR方法检测EGFR和Annexin-Ⅰ在各内膜组织中的表达,并比较其表达水平。结果:研究组异位内膜中EGFR的表达水平明显高于研究组在位内膜,研究组异位内膜Annexin-I的表达水平明显低于研究组在位内膜,二者差异均有高度统计学意义(P<0.01)。EMT重度组在位内膜及异位内膜中EGFR和Annexin-Ⅰ的表达水平与EMT轻度组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。对照组在位内膜组织及研究组在位内膜和异位内膜组织EGFR和Annexin-Ⅰ在分泌期和增殖期的表达水平比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:EGFR和Annexin-Ⅰ在EMT异位内膜表达水平的变化与EMT的发生、发展有关,而与子宫内膜的周期性变化无关。

2型糖尿病患者胰岛素受体胰岛素结合域基因突变的研究

目的:研究胰岛素受体结合域基因突变与胰岛素受体(INSR)功能异常的关系。方法:采用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)分析法和核酸银染法,对70例2型糖尿病患者INSR结合域基因第2,3,6三个外显子(exon)及部分相邻内含子进行基因突变检测。结果:在对外显子6的检测中发现有9例突变,突变又可分为B,C两种不同的SSCP带型。其中B型7例,C型2例,C型突变经测序结果,与外显子6的3′端毗邻的内含子的第43位A→C突变。在外显子3中发现了2例突变,为同一带型。在外显子2中尚未发现突变带型。结论:INSR结合域基因的突变在2型糖尿病中出现的频率较低。C型突变对INSR结合域的影响及其在2型糖尿病发病中的作用尚待进一步研究。

ARHI基因mRNA和蛋白表达水平与胶质瘤恶性度相关性探讨

目的探讨ARHI基因表达水平与人脑胶质瘤恶性度的相关性。方法采用RT-PCR和Western blot法检测10例正常脑组织、59例胶质瘤组织、4种胶质瘤细胞系(U251,SHG44,BT325,U87)中ARHI基因mRNA和蛋白的表达强度,结合临床病理资料统计分析。结果胶质瘤组织、细胞系中ARHI基因的表达水平显著低于正常脑组织,胶质瘤组织中ARHI的表达水平随肿瘤恶性程度增加而明显降低(P<0.01)。结论 ARHI基因mRNA和蛋白在胶质瘤中低表达,且表达水平与胶质瘤恶性程度负相关,提示ARHI基因低表达对胶质瘤的形成和恶性演变具有重要作用。

粗毛淫羊藿内转录间隔区序列扩增条件的优化

用CTAB法提取粗毛淫羊藿叶片DNA,进行内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列PCR扩增试验,通过单因子试验研究了退火温度、Mg2+浓度、TapDNA聚合酶浓度、dNTP浓度对ITS-PCR反应的影响,并通过各因子的组合研究,建立了适宜于粗毛淫羊藿ITS分析的扩增体系:25μL体系中2.5μL 10×buffer、1μL模板DNA、1.0 mmol/LMgCl2、1.5 mmol/L dNTP、1.25 UTaq酶、0.4μmol/L ITS 4、ITS 5。PCR反应程序为95℃5 min;94℃30 s,52℃45 s,72℃1 min,共35个循环;72℃7 min。粗毛淫羊藿ITS扩增条件的优化,可以为淫羊藿属遗传多样性的研究及分子鉴定奠定基础。

几种检测乳腺癌组织中血管内皮生长因子表达的方法学

目的 探讨建立适用于临床工作的检测乳腺癌组织中血管内皮生长因子(VEGF)表达的方法.方法 免疫组化法.RT-PCR、Western blot、Dot blot分析VEGF在乳腺导管癌组织的表达.结果 VEGF阳性细胞主要为肿瘤细胞,间质也着色.VEGF蛋白质分子量为46KD,含三种异构体.Dot bolt见于53%癌组织,VEGF表达水平高于癌旁组织.结论 Dot blot可作为临床工作中检测VEGF的初筛方法.

CD40基因多态性与自身免疫性甲状腺病的相关性

目的了解CD40基因多态性在西北地区汉族人群中的分布及其与自身免疫性甲状腺病(AITD)的相关性。方法随机选取本院内分泌科门诊的165例Graves病(GD)患者、113例桥本甲状腺炎(HT)患者为研究对象,以94例健康体查者为对照。①应用聚合酶链反应-限制性酶切片段长度多态性技术检测CD40基因5′非翻译区-1位点C/T多态性(5′UTR C(-1)T)、第三外显子58038位点-/T多态性;②应用扩增受阻突变系统-聚合酶链反应检测第九外显子64610位点C/G多态性。结果①5′UTR C(-1)T位点中CC基因型、C等位基因在GD组和对照组间有显著差异(P<0.05);②58038位点在372例样本中均为TT型;③64610位点未发现GG基因型。结论①西北地区汉族人CD40基因5′UTR C(-1)T位点上C等位基因型与GD发病有相关性,CC基因型者患GD的危险性较TT高;②58038位点-/T在西北地区汉族人中无多态性;③64610位点C/G在西北地区汉族人中未发现GG基因型。

MMP-9mRNA在食管鳞状细胞癌中的表达

目的探讨MMP-9mRNA在食管鳞状细胞癌及癌旁正常组织中的表达是否存在差异。方法应用RT-PCR(逆转录-聚合酶链式反应法)检测MMP-9mRNA在100例食管鳞状细胞癌组织及癌旁组织中的表达。结果 MMP-9mRNA在癌组织中的表达率为48.0%(48/100),MMP-9mRNA在癌旁组织中的表达率为16.0%(16/100),统计学分析差异有统计学意义(χ2=23.529,P=0.000);MMP-9mRNA的表达与肿瘤浸润深度有关(χ2=4.488,P=0.034),与肿瘤淋巴结转移无关(χ2=0.617,P=0.432),与患者性别无关(χ2=2.519,P=0.113),与患者年龄无关(χ2=3.107,P=0.078),与肿瘤分化程度无关(χ2=2.091,P=0.148)。结论 MMP-9可能在食管鳞状细胞癌的肿瘤产生及肿瘤进展方面起了促进作用,但在食管鳞状细胞癌淋巴结转移转移方面可能不发挥关键作用。

猪流行性腹泻焦磷酸测序检测方法的建立

本研究旨在建立一种基于RT-PCR的焦磷酸测序方法,以便对猪流行性腹泻(PED)进行高效准确地检测。利用PSQ Assay Design SW软件分析了猪流行性腹泻病毒(PEDV)N蛋白基因的保守区域,设计了一对扩增引物及一条测序引物,建立了PEDV N蛋白基因的焦磷酸测序检测方法。实验结果表明,该方法可以直接通过PSQ的序列结果直观地判定PEDV,大大提高了PEDV的检出率和准确性。该方法特异性强,不与其他猪源病毒发生交叉反应,最低核酸检测限为0.05 pg/μL。本研究所建立的焦磷酸测序方法灵敏度高、稳定性好,能从基因序列水平上精确鉴定PEDV,避免了假阳性结果的出现,对于PED的快速确诊具有重要意义。