山茱萸多糖的提取分离、化学结构及生物活性研究进展

山茱萸始载于《神农本草经》,在我国应用历史悠久,具有补益肝肾、涩精固脱的功效。多糖是山茱萸中被关注的主要活性成分之一,查阅近20年的国内外文献,综述山茱萸多糖常用的提取分离及纯化方法,并对山茱萸多糖化学结构特征和生物活性的研究现状进行总结。结果显示,山茱萸多糖的提取分离多采用经典的水提醇沉法,还有超声波提取法、微波辅助提取法、复合酶解法及稀碱提取法等,提取率范围为5.29%~18.92%;均一多糖的分离纯化多同时采用DEAE-纤维素柱、Sephadex及Sephacryl等多种分离填料层析获得,已明确均一多糖的分子量、单糖组成及比例、糖苷键类型和连接顺序的多糖共有9个。山茱萸多糖具有降血糖、抗肿瘤、抗氧化、免疫调节和肝脏保护等多种生物学活性,已成为近几年来有关山茱萸基础研究及产品开发的热点。综上所述,对山茱萸多糖的结构进行综合解析,基于肠道微生态探讨山茱萸多糖的构效关系及作用机制可能是未来的主要研究方向。

山茱萸多糖SZYP-2的结构分析

从中药山茱萸(FructusCorni)中分离得到多糖组分SZYP_2 ,它的糖基组成为鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖 ,单糖间的摩尔比是1∶3.3∶3∶3.8,通过部分甲基化、部分乙酰化后的气相色谱分析确定了各单糖间的连接点。

山茱萸多糖PFCCⅠ抗氧化性能研究

研究了山茱萸多糖PFCCⅠ的抗氧化性能。利用烘箱法研究多糖对油脂的抗氧化活性,结果表明,碱提山茱萸多糖PFCCⅠ可有效抑制植物油氧化;利用Fenton反应检测多糖PFCCⅠ对羟基自由基(·OH)的清除作用,当清除率达50%时所需浓度分别为80μg/mL;通过邻苯三酚自氧化反应检测二者对超氧阴离子自由基(O2-·)的清除能力,当清除率达50%时所需PFCCⅠ浓度为34.9μg/mL。

山茱萸多糖PFCAⅢ的理化性质及生物活性研究

目的 从山茱萸中分离山茱萸多糖 ,并研究其理化性质及生物活性。方法 山茱萸经热水抽提、Sevag法脱蛋白、乙醇沉淀、DEAE 纤维素柱色谱分离 ,再通过SephadexG 2 0 0柱色谱进一步纯化 ,得到白色粉末状多糖PFCAⅢ。对该多糖进行完全酸水解、薄层色谱、红外光谱分析 ,并研究其对油脂抗氧化性能及清除自由基能力。结果 PFCAⅢ由鼠李糖、阿拉伯糖和葡萄糖以α 糖苷键组成 ,对油脂具有一定的抗氧化能力 ,并对Fenton体系产生的羟基自由基及邻苯三酚自氧化体系产生的超氧阴离子自由基具有一定的清除能力。结论 PFCAⅢ对油脂具有抗氧化性 ,并可有效清除羟基自由基和超氧阴离子自由基。

山茱萸多糖对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用及机制探讨

目的:观察山茱萸多糖(polysaccharide from Fructus Corni,PFC)对大鼠心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤的保护作用,并探讨可能机制。方法:40只雄性SD大鼠,随机分为伪手术组(Sham)、缺血再灌注组(I/R)、PFC低、中、高处理组(25、100、200 mg·kg-1·d-1)。给药14 d后,采用结扎左冠状动脉前降支35 min,再灌注120 min的方法建立心肌I/R损伤模型。观察各组大鼠在缺血前、缺血30 min、复灌5、30、60、120 min时的左室收缩压(left ventricular systolic pressure,LVSP)、左室舒张末期压(left ventricular end diastolic pressure,LVEDP)和左室压上升、下降最大速率(±dp/dtmax);HE染色观察心肌组织病理改变;比色法测定血浆SOD、GSH-Px、CK活性和MDA含量;RT-PCR检测心肌肌浆网钙酶(sarcoplasmic reticulum calcium ATPase 2a,SERCA2a)mRNA的表达。结果:与I/R组相比,PFC(100、200 mg·kg-1·d-1)组LVSP和±dp/dtmax明显升高(P<0.01),LVEDP值显著降低(P<0.01);光镜下可见I/R组心肌纤维排列紊乱、断裂,水肿,炎细胞浸润;PFC(100、200mg·kg-1·d-1)组心肌细胞排列规则,仅有轻度充血、水肿。与Sham组比较,I/R组SOD、GSH-Px活性均显著降低(P<0.01),MDA和CK含量显著增高(P<0.01);与I/R组相比,PFC(100、200mg·kg-1·d-1)组SOD、GSH-Px活性增加,MDA含量降低(P<0.01),PFC(25 mg·kg-1·d-1)组与I/R组相比差异无统计学意义(P>0.05);而CK含量在PFC(25、100、200 mg·kg-1·d-1)组均显著降低(P<0.01);PFC(100、200mg·kg-1·d-1)组SERCA2a ATPase mRNA的表达较I/R组增多(P<0.01)。结论:山茱萸多糖可显著减轻大鼠心肌I/R损伤,其机制与减轻氧化应激,抑制细胞内钙超载有关。

水提山茱萸多糖的理化性质及抗氧化活性研究

山茱萸经热水抽提、Sevag法脱蛋白、乙醇沉淀、DEAE-纤维素柱层析分离,再通过Sephadex G-200柱层析进一步纯化,得到白色粉末状多糖PFCAIII。对该多糖进行完全酸水解、薄层层析、红外光谱分析,结果证明此多糖由鼠李糖、阿拉伯糖和葡萄糖以13.74:50.54:35.72的摩尔比组成,平均分子量为1.74×104。该多糖可以有效抑制猪油和芝麻油的氧化,并对邻苯三酚自氧化系统产生的超氧阴离子自由基(O2-·)具有一定的清除能力。用Fenton反应测定PFCAIII对羟基自由基(·OH)的清除作用,对·OH的清除率达50%所需浓度(EC50)为430μg/ml。

山茱萸多糖PFCAⅢ抗氧化性能研究

研究了山茱萸多糖PFCAⅢ的抗氧化性能。利用烘箱法研究多糖对油脂的抗氧化活性 ,结果表明水提山茱萸多糖PFCAⅢ可有效抑制植物油氧化 ;利用Fenton反应检测多糖PFCAⅢ对羟基自由基 (·OH)的清除作用 ,当清除率达 5 0 %时所需浓度为 4 30mg/L ;通过邻苯三酚自氧化反应检测PFCAⅢ对超氧阴离子自由基 (O-2 ·)的清除能力 ,当PFCAⅢ的添加浓度为 10 0mg/L时清除率为 2 1 5 %。

山茱萸多糖对自然衰老雌性小鼠卵巢功能的影响

目的观察山茱萸多糖对自然衰老雌性小鼠卵巢功能的改变。方法 3月龄小鼠为青年组对照,取14月龄左右自然衰老的雌性小鼠为老年组,然后灌服山茱萸多糖(青年组灌生理盐水)。24d后处死小鼠,测血清中激素水平,卵巢组织进行HE染色及电镜检测。结果 HE染色结果显示老年组与青年组比较,可见卵泡和黄体数量减少,闭锁卵泡较多,颗粒细胞消失或极薄而少;多糖组可见各级生长卵泡,部分卵泡周边可见较多而厚的颗粒细胞层,但卵泡数量较青年组少,闭锁卵泡减少。电镜结果显示老年组卵巢颗粒细胞数量明显减少,核膜粗糙,细胞器减少,可见染色质浓集于核边缘,多糖组凋亡征象明显改善。激素检测结果显示老年组孕激素(孕酮P)水平与青年组比明显较低,山茱萸多糖组孕激素值较老年组明显升高,差异显著(P<0.05);老年组与青年组比雄激素(睾酮T)值差异不显著,多糖组与老年组也无差异。结论山茱萸多糖可明显改善自然衰老雌性小鼠的卵巢功能。

山茱萸多糖提取过程研究

通过单因素实验及正交实验对提取液中多糖含量的各种影响因素进行了研究 ,确定了山茱萸多糖最佳提取工艺条件 :提取温度 80℃ ,提取时间 2h ,料液比 1∶16,原材料粒度 3 0 0～ 45 0 μm ,提取次数 4次 ,脱蛋白次数 6次。在此条件下提取并用DEAE cellulose柱层析分离得到白色多糖PFCAⅢ 。

山茱萸炮制前后多糖的含量变化研究

目的测定并考察山茱萸炮制前后多糖的含量变化,以探讨山茱萸的炮制机理。方法采用苯酚-硫酸法测定山茱萸炮制前后多糖的含量。结果生品总糖含量为51.41%,得率为10.12%;制品总糖含量为53.10%,得率为5.91%,较生品多糖得率下降了41.60%。结论山茱萸经酒蒸制后,多糖得率降低。实验结果为探讨山茱萸炮制机理提供了一定的依据。

ROS/PKC/p38 MAPK途径在山茱萸多糖抑制心肌细胞缺氧/复氧损伤的作用

目的:观察山茱萸多糖(polysaccharide from Fructus corni,PFC)对缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)损伤心肌细胞的保护作用,并探讨其对ROS/PKC/p38 MAPK途径的影响。方法:分离原代乳鼠心肌细胞,建立H/R模型,细胞分为7组:正常对照组(N组)、缺氧/复氧组(H/R组)、缺氧/复氧+PFC(终浓度20 mg/L、100mg/L和200 mg/L)预处理组、缺氧/复氧+PFC(100 mg/L)预处理+蛋白激酶C特异性阻断剂chelerythrine(1μmol/L)组及缺氧/复氧+PFC(100 mg/L)预处理+p38 MAPK特异性阻断剂SB203580(10μmol/L)组。倒置显微镜下观察细胞形态和自发搏动频率,Hoechst 33258染色观察细胞凋亡率,酶标仪测定ROS含量、SOD活性及LDH漏出量,免疫印迹法检测PKC、p-p38 MAPK和HSP70的蛋白水平。结果:H/R组细胞活力下降,搏动频率减慢,细胞ROS含量、LDH漏出量、细胞凋亡率及p-p38 MAPK的水平均较N组显著增加(P<0.01)。经PFC预处理后,细胞搏动频率、SOD活性及PKC、HSP70的水平较H/R组显著增加(P<0.05,),p-p38 MAPK的水平和细胞凋亡率均减少(P<0.05),而PFC的保护作用能被chelerythrine或SB203580抑制。结论:山茱萸多糖可抑制心肌细胞缺氧/复氧损伤,其作用可能与增加SOD活性、抑制ROS产生、激活PKC并抑制p38MAPK的过度激活有关。

山茱萸多糖对HDF细胞β-半乳糖苷酶及p16表达的影响

目的探讨山茱萸多糖对抗HDF细胞衰老的作用及其可能的调控机制。方法体外培养人胚肺二倍体成纤维细胞(HDF),实验组从40代开始加多糖含药血清,观察细胞形态,MTT法检测细胞活力,分光光度法检测β-半乳糖苷酶活性,免疫组化法检测p16蛋白的表达。结果衰老组细胞活力下降,β-半乳糖苷酶含量升高,p16蛋白表达阳性细胞数升高;山茱萸多糖可提高细胞活力、降低β-半乳糖苷酶含量,p16蛋白表达阳性细胞数下降。结论山茱萸多糖可通过改变p16的表达而发挥其抗HDF细胞衰老作用。

山茱萸多糖对肺癌细胞的凋亡作用及Bcl-2、Bax表达的影响

目的探讨山茱萸多糖对人肺癌A549细胞凋亡的作用及凋亡相关基因表达的影响。方法采用MTT法、DNA琼脂糖凝胶电泳法、免疫组化SP法检测山茱萸多糖对A549细胞凋亡作用及Bcl-2、Bax蛋白表达的变化。结果山茱萸多糖对A549细胞抑制作用明显,抑制程度与质量浓度呈正相关;DNA琼脂糖凝胶电泳出现相差约200 bp的DNA梯形条带,免疫组化SP法染色显示Bcl-2的表达下降,Bax的表达上升。结论山茱萸多糖对人肺癌A549细胞的增殖有较强抑制作用,能诱导细胞凋亡,其机制与下调Bcl-2的表达,上调Bax的表达有关。

山茱萸多糖的提取及含量测定

目的从山茱萸中提取多糖,并建立山茱萸多糖含量的测定方法。方法采用均匀设计优化山茱萸多糖的提取条件,用热水浸提、乙醇沉淀、DE-52柱层析的方法提取纯化山茱萸多糖,用苯酚-硫酸比色法测定多糖含量。结果山茱萸中多糖的含量为16.04%,平均回收率为99.01%,RSD=1.13%(n=3)。结论首次运用均匀设计优化山茱萸多糖的提取条件,提取得率高,苯酚-硫酸比色法测定山茱萸多糖含量稳定性、回收率较好。

微波辅助提取山茱萸多糖的工艺优化

[目的]优化微波辅助提取山茱萸（FRUCTUS CORNI）多糖的提取工艺。[方法]在全面单因素试验的基础上,先采用Plackett-Burman设计对7个因素进行试验,筛选出影响最大的3个因子,并确定其余因素的最优水平,再利用响应面法设计对3个主要因子进行试验和优化,建立了二次多项式数学模型。[结果]微波功率、液料比和乙醇体积分数是主要因子,最佳工艺条件是：山茱萸粉末直径在300~450μm之间,料液比1∶19.7（g∶m l）,微波功率624 W,辐照时间55 s,水浴温度90℃,浸提时间2 h,乙醇体积分数为68.4%,在此条件下,多糖得率达20.94%。[结论]该方法误差小、数据可靠,可用于山茱萸多糖的提取。

微波辅助提取山茱萸多糖工艺优化

利用微波辅助技术提取山茱萸多糖。在单因素试验的基础上以乙醇浓度、液料比和微波功率为试验因素,以多糖提取率为响应值,采用3因素3水平的响应面分析法进行试验。结果表明,山茱萸多糖提取的最佳工艺条件:浸泡时间120min,微波功率456W,料液比1∶33(m∶V),微波处理时间3.2min,实际测得多糖提取率为11.12%,与模型预测值基本相符。

微波辅助提取山茱萸多糖的工艺研究

采用单因素试验和正交试验,进行了微波辅助提取山茱萸多糖的研究,得到了微波辅助提取山茱萸多糖的最佳工艺条件是料液比为1∶25(m/V,g∶mL),微波功率为560 W,微波处理时间为10 min,浸提时间为70 min。在此工艺条件下,多糖平均提取率为10.53%。与热水浸提法进行比较,微波辅助提取能缩短提取时间,提高山茱萸多糖提取率。

山茱萸多糖炮制前后的化学研究

目的:对比炮制前后山茱萸多糖分子量和组成的变化,探讨炮制对其结构和组成的影响,阐述山茱萸多糖炮制增效的机理。方法:经脱脂、沸水提取,乙醇沉淀、Savage法脱蛋白得到粗多糖,再经DEAE-52阴离子交换树脂和SephadexG-200葡聚糖凝胶柱色谱分离得到纯化的山茱萸精多糖(SZYS和SZYP),用红外光谱和紫外光谱分析其结构,凝胶色谱测定其相对分子量,HPLC测定其单糖组成。结果:分离得到了山茱萸多糖SZYS,其分子量为3.59×104,单糖组成为Glu∶Ara∶Rha=1∶1.51∶1.17;山茱萸多糖SZYP,分子量为1.16×104,单糖组成为Glu∶Ara∶Rha=1∶8.05∶1.78。结论:炮制前后山茱萸多糖分子量和单糖组成均发生变化,为山茱萸炮制增效的机理研究提供一定的依据。

山茱萸多糖的提取及纯化工艺研究

本实验对山茱萸中水溶性多糖的提取纯化工艺进行了研究。通过单因素试验和均匀设计试验,研究了温度、时间、料液比对多糖提取得率的影响,结果显示:提取温度是影响多糖提取得率的主要因素,最佳提取工艺为料液比1:36,温度100℃,时间180min,在此条件下,山茱萸多糖提取得率为199.36mg/g。通过乙醇沉淀、透析、DE-52柱层析对提取的山茱萸粗多糖进行纯化。纯化的山茱萸多糖经紫外光谱分析不含蛋白质和核酸,琼脂糖凝胶电泳得到单一区带,表明为分子大小均一的单一组分多糖。

山茱萸保健果冻的研制

[目的]从山茱萸中提取多糖,并制作出爽滑可口的保健果冻。[方法]利用水提醇沉的方法,将山茱萸中的多糖提取出来,通过正交试验确定果冻制作的最佳工艺。[结果]山茱萸果冻的最佳配方为山茱萸多糖10%、卡拉胶0.6%、CMC-Na0.1%、白砂糖8%、甜叶菊溶液1.5%、柠檬酸0.2%、柠檬酸钠0.02%、香精0.05%～0.10%。[结论]通过此配方制作出的山茱萸果冻质量指标符合要求。