哺乳动物精卵识别及阻止多精入卵机制的研究进展

哺乳动物卵子的受精过程是由减数分裂产生的高度特化的精子和卵子之间进行相互识别和融合的过程,其中精子与卵子透明带和质膜的特异性识别是完成正常受精的关键。正常条件下,一个精子和一个卵母细胞进行特异性识别后融合才能形成合子,并完成一系列的转变,从而开启新个体的发育。而多个精子通过卵子透明带和质膜会造成多精入卵现象,导致胚胎发育失败。精子与卵子相遇后,精子表面蛋白与卵子透明带糖蛋白及质膜蛋白之间的特异性识别,是保障正常受精并阻止多精入卵的关键。文章围绕精子与卵子透明带蛋白和质膜上负责特异性识别的蛋白及其相关作用机制进行了综述,并对皮质反应、透明带反应和卵黄膜反应在去除卵子对应特异性蛋白方面的作用进行探讨,以期为家畜体外受精技术的发展提供理论支持和新的思路。

卵巢储备功能下降患者常规体外受精多精受精发生的影响因素分析

目的探讨卵巢储备功能下降(DOR)人群行常规体外受精(IVF)过程中多精受精发生的影响因素。方法本研究为回顾性病例对照分析。收集2020年9月至2023年5月在山西省运城市中心医院生殖医学科接受IVF治疗的399例DOR患者(共399个周期)的临床资料。按照本周期是否发生多精受精,分为正常受精组(272个周期)和多精受精组(127个周期),比较两组患者的基本情况及促排卵情况,并采用Logistic回归模型分析多精受精的相关影响因子。结果纳入研究的DOR患者IVF周期的多精受精发生率为31.83%(127/399)。正常受精组和多精受精组间女方年龄、不孕年限、不孕类型、基础窦卵泡数(AFC)及促性腺激素(Gn)启动剂量比较均无显著性差异(P>0.05);多精受精组的肥胖人群占比、Gn天数、Gn总量、扳机日E_(2)和孕酮水平以及获卵数均显著高于正常受精组(P<0.05),扳机日LH水平则显著低于正常受精组(P<0.05)。Logistic回归分析表明:Gn天数、Gn总量、扳机日E_(2)、LH和孕酮水平对多精受精的发生无显著影响(P>0.05);而女性体质量指数(BMI)和获卵数对多精受精的发生有显著影响(相关统计数据分别为OR=2.858,P=0.020;OR=1.634,P=0.000)。结论女性BMI和获卵数是DOR人群中IVF周期多精受精发生的独立危险因素。肥胖的DOR患者在IVF助孕治疗过程更容易出现多精受精的情况。

牛体外受精的程序及超微结构研究

牛体外成熟卵母细胞体外受精后３小时精子入卵，８小时原核形成，２４小时原核迁移到卵中央．精子发生顶体反应的部位主要在透明带表面，方式是顶体外膜自身囊泡化。发生顶体反应的精子可斜向或垂直穿过透明带、卵丘细胞可吞噬大量精子．在阻止多精受精中发挥重要作用。高尔基复合体、线粒体、环状片层和滑面内质网等在原核周围形成细胞器集团。牛体外受精卵的雌雄原核结合比体内受精的要延迟，胞吐到卵周隙中的皮质颗粒内容物扩散不完全。

斧文蛤精子超微结构与受精过程的细胞学变化

采用电镜和荧光显微镜技术,对斧文蛤精子超微结构与受精过程的细胞学变化进行了系统研究。电镜观察表明,斧文蛤精子为鞭毛型,全长45.2～47.7μm,由头部、中段和尾部三部分组成。头部呈稍弯曲的狭茧形,长约2.5μm,由顶体和细胞核组成,顶体呈圆锥形,内部中轴处有亚顶体腔;细胞核为长锥形,有核前窝和核后窝。中段由线粒体围绕中心粒复合体构成,5个近球形的线粒体呈单层梅花状排列;中心粒复合体由近端中心粒和远端中心粒组成,远端中心粒延伸出尾部的轴丝。尾部为细丝状鞭毛,内部的轴丝呈典型的"9+2"结构,外周有波浪状质膜包被。用荧光显微镜观察了斧文蛤受精及早期卵裂过程的细胞学变化,结果发现,斧文蛤成熟未受精卵呈圆球形,核相处于第一次成熟分裂中期;在水温27～28℃条件下受精,受精后6 min,精子入卵并膨胀成球形;受精后12～15 min、20～25 min受精卵排出第一、第二极体;30 min左右,精、卵核膨胀形成雄、雌原核;35 min,两性原核在卵子中央发生染色体联合;40～45 min,受精卵进行第一次卵裂,形成2个大小不等的分裂球;55～60 min,第二次卵裂结束,形成1大3小4个卵裂球,核相变化与第一次卵裂基本相同;75～80 min,第三次卵裂完成,自此次起开始进行螺旋分裂。另外,在斧文蛤受精过程中发现了约1%的多精入卵现象,其对成熟分裂和早期卵裂过程影响很大,常造成成熟分裂紊乱和第一次卵裂染色体分离异常。

刺参受精及早期胚胎发育过程的细胞学观察

采用HOECHST 33258染色荧光显微方法,对刺参成熟未受精卵以及受精过程中精子入卵、极体排放、雌雄原核的形成与结合、早期卵裂以及多精入卵等细胞学进行了研究。结果显示,刚产出的刺参成熟未受精卵呈圆形,核相处于第一次成熟分裂中期;在水温22～23℃、盐度29条件下进行受精,受精后12 min,完成第一次成熟分裂,释放第一极体;受精后20 min,大部分受精卵完成第二次成熟分裂,放出第二极体。受精后35 min,雌、雄原核开始在卵中央发生染色体联合;受精后80 min,部分受精卵完成第一次卵裂,受精后100 min,部分受精卵完成第二次卵裂。刺参在受精过程中存在极少数的多精入卵现象。

栉孔扇贝受精卵减数分裂的细胞学研究

1 材料与方法1.1 材料栉孔扇贝(Ｃｈｌａｍｙｓｆａｒｒｅｒｉ)亲贝,1997年5月取自青岛石老人养殖场,入池后雌雄分开暂养。ＤＡＰＩ(4’,6-ｄｉａｍｉｄｉｎｏ-2-ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ)为美国Ｓｉｇｍａ公司产品。1.2 方法挑选性腺?..

近江牡蛎受精细胞学研究

用醋酸──地衣红染色的方法对近江牡蛎人工授精的卵子减数分裂和受精过程进行了详细的细胞学观察．精子入卵前，卵子处于第一次减数分裂的前期（胚泡期），精子入卵后，胚泡消失，然后进行两次减数分裂，在海水温度为２８．８℃的情况下，授精后３３ｍｉｎ和４５ｍｉｎ，绝大部分受精卵已排出第一极体和第二极体，雄原核可在第一极体排出后及第二极体排出前任何时期内形成，雌雄原核以联合的方式将两组染色体合并，授精后１ｈ，大部分卵子完成第一次卵裂．在２５℃和２６℃授精的情况下，观察到了较多的多精入卵的现象．卵子发育的非同步性现象非常明显．

短时受精后提早剥离颗粒细胞对体外受精的影响

【目的】研究在人体外受精过程中提早剥除颗粒细胞对受精和发育的影响。【方法】对本中心行短时受精（5 h）的53对夫妇纳入研究,当其精卵孵育5 h之后,将所用卵子平均分为2组（5 h组和19 h组）,分别于受精5 h和19 h时剥除颗粒细胞。观察两组中同一批卵子受精情况并用荧光原位杂交（FISH）技术分析多原核胚胎中原核（PN）来源。【结果】5 h组和19 h组两组之间的正常受精率（两原核率）、单原核率和未成熟卵率相似,差异均无统计学意义,然而多原核率在5 h组明显高于19 h组﹝（10.9±12.4）%vs.（4.5±7.6）%,P=0.001﹞。同时在5 h组中正常受精卵子原核的直径在受精后19 h时明显大于19 h组的正常受精卵子原核的直径[（24.27±2.20）μm vs.（20.90±3.14）μm,P=0.0001﹞。培养至第3天时两组的可利用胚胎率和优质胚胎率相似,差异无统计学意义。FISH的结果显示,两组多原核胚胎中原核的Y染色体/X染色体的比例为0.533~0.547,理论上更接近于多精受精。【结论】提早剥除颗粒细胞不影响人胚胎的体外发育,但是可能会影响原核的发育并导致体外受精过程中多精受精比例的增加。

猪卵母细胞的体外受精及多精受精

对用于猪体外受精 (IVF)的研究方法和技术 ,如传统的液滴IVF、透明带下注射精子受精 (SUZI)、卵母细胞质内单精注射受精 (ICSI)及细管IVF等进行了简述。与其它动物相比 ,进行猪卵的体外受精研究 ,多精受精现象特别明显。大量的研究表明 ,猪卵的多精受精不但与其品种特性有关 ,而且与卵母细胞成熟的程度、透明带的异常、受精时获能精子的浓度、输卵管分泌物、受精液蛋白添加成分、NaHCO3 浓度、咖啡因、pH值以及温度等因素密切相关。

体外受精—胚胎移植中不同授精浓度对胚胎质量及妊娠结局的影响

目的通过比较不同授精浓度下胚胎发育及妊娠结局，探讨体外受精-胚胎移植（WF-ET）中较为合适的授精浓度。方法对因输卵管因素接受1VF-ET的夫妇进行随机对照试验，根据不同授精浓度随机分为3组：A组为（0．1～0．5）×106／mL，B组为（0．5-1．0）×10^6／mL，C组为（1．0-1．5）×106／mL。比较3组间正常受精率、多精受精率、卵裂率、优质胚胎率、临床妊娠率、着床率及流产率。结果3组的正常受精率、卵裂率、优质胚胎率及流产率均无统计学差异（P〉0．05），但B组和C组的多精受精率（分别为14．9％和13．2％）明显高于A组（8．6％）（P〈0．05），而且C组的妊娠率及种植率（50．0％，29．5％）明显高于B组（41．4％，20．4％）和A组（38．6％-18．8％）（P〈0．05）。结论IVF．ET治疗中，增加授精滴中精子浓度可导致卵子多精受精增加，但在一定范围内增加精子浓度可能改善妊娠结局。

人工复合三倍体鲤卵的受精生物学研究

本文对人工复合三倍体鲤成熟卵的受精生物学进行了研究。结果表明，三倍体卵外壳具有凸凹不平的表面，与正常二倍体卵比较有明显差异。受精生物学观察发现有些卵为多精受精，进入卵的所有精子都能形成雄性原核，排出一个极体，但绝大部分受精卵在发育期间分裂不齐、畸形、直至死亡，只有具有三套完整染色体的卵子的雌核才能发育成为三倍体个体。三倍体鲤的成熟分裂不是完全的均等分裂，有些不等分裂的卵母胞核中只有两套染色体，或一套染色体，甚至是一套半染色体。

缢蛏受精和早期卵裂过程的细胞学变化观察

采用普通光镜、荧光显微镜和石蜡切片技术,对缢蛏受精和早期卵裂过程中的精子入卵、减数分裂、雌雄原核形成与结合、早期卵裂以及多精入卵等细胞学事件进行了显微观察。结果表明,缢蛏成熟未受精卵多呈圆球形或卵圆形,少数呈梨形,卵径为82～88μm,核相处于第一次成熟分裂中期;精子为典型的原生型,全长55～58μm,头部呈保龄球形,顶体前端的顶体杆呈特别细长的花丝状;在水温21～22℃、盐度10的条件下进行人工授精,精、卵混合后,精子迅速附着于卵子表面,启动卵子发育;受精后4～6 min,精子的头部已进入卵内并明显膨胀,卵子外形变圆,卵外附着的精子量明显减少;在受精后12～15 min、20～25 min,受精卵先后排出第一极体、第二极体,完成两次成熟分裂;第二次成熟分裂结束以后,精、卵核体积迅速膨胀,雄原核的膨胀早于雌原核,核膜重建,在受精后约30 min形成雌、雄原核;雌、雄原核均向卵子中央移动,雄原核旁边的精子星光清晰可见,随后二者在卵子中央以染色体联合的方式结合,联合核的染色体共同排列在纺锤体的赤道板上,形成第一次有丝分裂的中期分裂相;受精后40 min左右,受精卵进行第一次卵裂,染色体在纺锤丝的牵引下向两极移动,结果形成2个大小不等的卵裂球;受精后45～50 min,卵子进行第二次卵裂,核相变化与第一次卵裂相同,在与第一次卵裂垂直的纵轴方向上发生不等全裂,最终形成3小1大4个卵裂球;受精后60～70 min,胚胎进行第三次卵裂,仍为不等全裂,但自此次卵裂起已开始进行螺旋分裂。此外,对实验中发现的缢蛏极少量多精入卵、多极分离等异常细胞学现象进行了分析,并探讨了海洋贝类卵子阻止多精入卵发生的机制。

体外受精中皮质颗粒与多精受精的相关性

目的通过观察小鼠及人不同受精状态时皮质颗粒(CG)的分布情况及分级,找出体外受精(IVF)中CG与多精受精的相关性,以期指导IVF的临床工作。方法选择小鼠不同成熟时期及小鼠和人不同受精状态的卵母细胞,经荧光标记后分别观察CG的分布和迁移情况。结果小鼠2PN的卵母细胞中92.2%的CG分布为Ⅲ级,3PN的卵母细胞中8.6%的CG分布为Ⅲ级;人2PN的卵母细胞中100.0%的CG分布为Ⅲ级,3PN的卵母细胞中17.6%的CG分布为Ⅲ级;小鼠卵母细胞成熟后,体外培养时间分别延长到48和60 h,CGⅢ级所占比例分别降至73.3%和20.0%,同时体外受精的3PN率逐渐增加到10.0%和16.7%。结论 3PN卵母细胞中CG释放不完全,因而不能阻止多精受精;过熟或老化的卵母细胞,CGⅢ级所占比例下降,而3PN率上升;证实了小鼠及人IVF中CG与多精受精具有明显的相关性。

多精受精原因和机理

多精受精是哺乳动物卵母细胞较普通的一种异常受精形式,生理情况下体内很少发生多精受精,然而人工治疗手段则增加多精受精的发生率.要了解多精受精发生的原因和机制,首先来了解正常受精机制.

刺五加开花后雌蕊的发育状态与受精作用

刺五加Ｅｌｅｕｔｈｅｒｏｃｏｃｃｕｓｓｅｎｔｉｃｏｓｕｓ（Ｒｕｐｒ．ｅｔＭａｘｉｍ．）Ｍａｘｉｍ．植株在开花后雌配子体的发育状态与一般植物不同在于：雌配子体在开花当天均未成熟，在开花后经４～５天才发育成熟。开花第６天，雌株和两性株的成熟胚囊百分率各为８２．２５％和６７．２５％，其余为未育、败育、退化或未成熟胚囊，未观察到已受精的胚囊；而此时，雄株的雌配子体退化、花朵全部脱落。伴随着胚囊的分化，刺五加雌株和两性株的花柱逐渐延长，蜜腺渐趋成熟。开花后４～６天，乳突细胞发育，柱头开始外翻；此后，蜜腺分泌花蜜，柱头进入可授期。开花第７天，胚囊开始受精。开花后９～１０天，雌株已受精的胚囊占胚囊总数的４０～６５％，两性株已受精的胚囊占胚囊总数的２５～４１％。刺五加花粉萌发至雌雄性核融合的间隔期约为２～３天。刺五加的双受精过程与一般被子植物基本相同。其受精作用属于有丝分裂前配子融合类型。此外，还观察了成熟胚囊退化的类型，观察到多余花粉管进入胚囊以及两个精子与卵受精、两个精子与次生核融合的图象。

青蛤受精和早期卵裂过程中核相的细胞学变化

利用Hoechst 33258染色、荧光显微镜观察方法,对青蛤(Cyclina sinensis(Gmelin))受精和早期卵裂过程中的核相变化进行了细胞学研究。结果表明:青蛤成熟未受精卵呈圆球形,核内同源染色体排列整齐,核相处于第一次成熟分裂中期。在水温25～26℃条件下进行人工授精,精卵混合后,精子迅速附着于卵子表面;受精后5～10 min,精子进入卵内并明显膨胀成球形;分别在10～15 min、20～25 min受精卵进行两次成熟分裂,排出第一、第二极体;30 min左右,精、卵核体积膨胀,形成弥散状的雌、雄原核;35 min,雌、雄原核在卵子中央发生原核联合,染色体共同排列在纺锤体的赤道板上,形成第一次有丝分裂的中期分裂相;40～45 min,受精卵进行第一次卵裂,形成2个大小不等的分裂球;55～60 min,第二次卵裂结束,形成1大3小4个卵裂球,卵裂过程中的核相变化与第一次卵裂基本相同;70 min左右,胚胎开始第三次卵裂。另外,在青蛤受精过程中发现了约1%的多精入卵现象,且入卵精核均能形成雄原核,但多精受精对成熟分裂和有丝分裂过程有很大影响,往往造成成熟分裂紊乱和第一次卵裂染色体分离异常。

短时受精对体外受精妊娠结局的影响

【目的】研究短时受精(2 h)对体外受精(IVF)多精受精率以及妊娠结局的影响。【方法】对本中心658名IVF患者进行随机分组,分为2 h受精组(A组)和常规受精组(B组),研究2 h受精对IVF受精率(2PN率)、多精受精率(>2PN率)、胚胎质量、临床妊娠率和种植率的影响。【结果】在658名IVF患者中有61名患者由于取消ET没有纳入最后统计,2 h受精组和对照组分别有294和303名患者参与。统计结果显示,短时受精组与对照组相比2PN率显著下降(68.8%vs72.1%,P<0.05),而短时受精组与对照组多精受精率(11.4%vs 11.7%,P>0.05)、可用胚胎率(86.5%vs 86.1%,P>0.05)、临床妊娠率(47.6%vs 42.6%,P>0.05)和种植率(28.6%vs 26.5%,P>0.05)没有统计学意义。【结论】2 h受精没有降低多精受精率,对临床结局没有明显改善作用。

哺乳动物卵母细胞透明带结构及其在体外受精中的作用

卵母细胞在成熟过程中经过减数分裂和分化形成配子,卵母细胞透明带（ZP）主要具有ZP1、ZP2、ZP3以及ZP4等4种结构蛋白。不同物种中ZP结构不同,且卵母细胞ZP在体外受精过程中能够阻止多精入卵。文章主要综述了卵母细胞ZP的结构和其在体外受精过程中的作用机制,以期为研究体外受精提供参考。

高血清LH和E_(2)水平可能增加仅获一个卵母细胞的IVF周期的多精子受精风险

目的探究可能影响单一卵母细胞(获卵数为1)受精结局的血清激素及其浓度截断值。方法回顾性分析2015年1月至2019年12月于本生殖中心行常规IVF助孕且仅获得一个卵母细胞的433例患者临床资料,按照其卵母细胞受精结局的不同,将患者分为IVF-2PN组(n=326)和IVF-3PN组(n=107)。对比分析两组患者的基本资料、Gn总量、HCG总量、基础激素(FSH、LH、E_(2)、PRL)水平以及Gn日和HCG日血清激素水平之间的差异;通过Logistic回归模型分析单一卵母细胞发生多精子受精的危险因素,并利用ROC曲线计算影响单一卵母细胞受精结局的激素浓度截断值。根据浓度截断值进行亚分组分析,比较不同激素浓度组间的受精结局差异。结果两组患者年龄、不孕年限、BMI、基础FSH、基础LH、基础PRL水平、Gn日血清FSH水平、HCG总量及HCG日血清FSH及E_(2)水平均无显著性差异(P>0.05)。与IVF-2PN组相比,IVF-3PN组的血清基础E_(2)水平、Gn日血清LH及E_(2)水平、HCG日血清LH水平显著升高(P<0.05),Gn总量显著下降(P<0.05)。Logistic回归分析结果表明:血清基础E_(2)水平、Gn总量、Gn日血清LH及E_(2)水平、HCG日血清LH水平均与单一卵母细胞多精子受精存在显著相关性(P<0.05)。ROC曲线计算结果显示基础血清E_(2)浓度截断值为258.74 pmol/L[AUC=0.533,95%CI(0.482,0.583),P=0.200];Gn日血清LH浓度截断值为6.32 U/L[AUC=0.583,95%CI(0.534,0.632),P=0.001]、E_(2)浓度截断值为471.60 pmol/L[AUC=0.575,95%CI(0.526,0.624),P=0.003];HCG日血清LH浓度截断值为3.28 U/L[AUC=0.591,95%CI(0.542,0.639),P=0.000]。将不同时间点各激素浓度联合起来作为多因素进行ROC曲线分析,结果为[AUC=0.631,95%CI(0.569,0.693),P=0.000],AUC面积增加且P<0.05。亚组分析结果显示,当激素浓度高于对应的截断值时,IVF-2PN比例显著降低,而IVF-3PN比例显著增加(P<0.05)。结论血清激素水平对单一卵母细胞多精子受精的预测价值需要综合考虑LH和E_(2)两种激素浓度的动态变化。当血清基础E_(2)水平、Gn日血清LH和E_(2)水平、HCG日血清LH水平分别高于对应的浓度截断值时,可能会增加单一卵母细胞发生多精子受精的风险。

多精受精与卵细胞数、受精率、授精密度及时间关系的探讨

为研究多精受精与卵细胞数量、受精率、授精密度及时间之间的关系 ,将 12 6例实施体外受精—胚胎移植 (IVF- ET)的患者分为多精受精组与非多精受精组 ,分别统计两组的卵细胞数、受精率、授精密度及受精时间。结果显示 ,多精受精组卵细胞数 15 .5 4± 7.16枚 ,受精率 0 .81± 0 .13,授精密度 40 .40± 5 .12万精子 /卵细胞 ;非多精受精组分别为 11.6 2± 5 .0 9枚、0 .6 5± 0 .2 3、38.5± 5 .6 7万精子 /卵细胞。长时受精与短时受精多精受精率分别为 4.5 %、5 .5 %。两组相比 ,卵细胞数、受精率间有显著差异 (P<0 .0 0 1、<0 .0 1) ,授精密度间无显著差异(P>0 .0 5 ) ,受精时间无显著差异 (P>0 .0 5 )。提示多精受精与卵细胞数、受精率有关 ,与授精密度及时间无关。