杨树腐烂病菌SNARE蛋白CcNyv1的功能

【目的】解析SNARE蛋白Nyv1在杨树腐烂病菌中调控囊泡运输相关过程的功能,探究该病菌在生长发育和致病过程中的作用机制,为阐明SNARE蛋白在杨树腐烂病菌致病过程中的调控机制提供理论依据,并为该病害防控提供参考。【方法】1)利用酿酒酵母Nyv1的氨基酸序列进行Blastp分析,获得其同源的CcNyv1基因;2)利用生物信息学软件对CcNyv1编码的氨基酸序列和其他真菌中的Nyv1同源序列进行多序列比对,并构建系统发育树;3)采用Split-marker方法和PEG介导的遗传转化体系,构建CcNyv1基因缺失突变体及其回补菌株;4)通过PDA平板生长试验观察菌丝生长速率,分析CcNyv1基因及其Longin、SNARE结构域对菌丝的营养生长和盐胁迫响应的影响;5)通过对1年生杨树枝条烫伤接种观察病斑扩展面积,评价CcNyv1基因及其Longin、SNARE结构域对杨树腐烂病菌致病力的影响;6)利用FM4-64染剂染色,探究CcNyv1基因和Longin、SNARE结构域对该病菌的内吞作用产生的影响。【结果】1)通过酿酒酵母Nyv1的氨基酸序列blast比对,在杨树腐烂病菌中获得其同源基因CcNyv1,该基因全长780 bp,包含1个内含子,编码1个233 aa的囊泡运输相关R-SNARE蛋白,该蛋白含有1个N端的Longin结构域和1个C端的SNARE结构域;2)多序列对比和系统发育分析表明,CcNyv1和其他子囊菌中的Nyv1同源基因具有较高的序列相似度,且在进化上较为保守,与寄生隐丛赤壳中的同源基因的亲缘关系最为接近;3)成功构建CcNyv1基因缺失突变体、Longin结构域缺失突变体、SNARE结构域缺失突变体和CcNyv1基因回补菌株;4)菌丝生长表型和侵染杨树枝条致病表型分析表明,CcNyv1基因缺失突变体和Longin、SNARE结构域缺失突变体在菌丝营养生长、盐胁迫响应以及致病力等方面存在明显缺陷;5)比较FM4-64染色后野生型和缺失突变体菌株的囊泡分布情况,可见CcNyv1基因和Longin、SNARE结构域影响杨树腐烂病菌的内吞作用。【结论】杨树腐烂病菌SNARE蛋白CcNyv1在营养生长、胁迫应答、致病力及内吞作用等方面发挥重要调控作用。

杨树烂皮病生物防治的研究

通过已筛选出的对杨烂皮病有明显拮抗作用的5种菌种:,Trichoderma sp.,Penicillinm sp., Aspergillus sp., Eurotium sp., Fusarium sp., 用PDA固体培养基和查彼(czapek)培养液培养,分别获得各菌种抱子和发酵液,对扬烂皮病树刮皮喷雾防治,进行林间筛选试验。室内测定结果表明:平扳对峙培养,Trichoderma sp.和Fusarium sp.的抑菌效果好于其它三种拮抗菌;孢子萌发试验,5种菌的培养过滤液均对病菌孢子萌发有较强的抑制作用;接种试验,先接拮抗效果最好,为33.3％—100％,混合接效果要次之,为0％—72.2％,后接效果最差,为5.6％—33.3％。林间筛选试验结果表明,孢悬液防治效果好于发酵液防治,其中Tyichodeyma sp.和Fusayium sp.的防治效果最好,而且在树干上存活时间较长。治愈率除Aspergillus sp.外,均达70％以上。

东北杨树烂皮病发生流行的时空分析

利用数理统计和空间分析方法,对2002-2009年黑龙江省、吉林省、辽宁省和内蒙古自治区杨树烂皮病发生的时间和空间特点进行分析。结果表明:近8年,东北4省(区)均有不同程度杨树烂皮病发生,其中辽宁省发生杨树烂皮病的面积最大,尤其在2006年以后,平均发生2.69万hm2/年;吉林省,黑龙江省和内蒙古自治区发生的面积较小。近2年东北4省(区)杨树烂皮病的发生均有上升趋势;东北4省区的杨树烂皮病发生地主要集中在中东部,其中吉林省的松原市近8年来,每年都有杨树烂皮病发生,平均0.360 7万hm2/年。此项研究将为林业部门和气象部门建立杨树烂皮病发生发展气象预报与灾损评估服务平台,开展该病害的预测预报和影响评价提供必要的研究基础。

江苏杨树烂皮病发生状况调查及化学防治试验

通过对江苏省杨树烂皮病发生状况调查发现,在新沂,六合和仪征3个地区有杨树烂皮病发生。在调查的4 417株杨树中,平均发病率占11.32%;杨树烂皮病的发生与树种、树龄、地形、土壤、坡向以及虫害的关系均较密切。苗圃内不同药剂、配比度对杨树苗刮皮后的涂药试验发现,吡唑醚菌酯500,1 000,1 500倍液3种配比度的防治效果均在88%以上,嘧菌酯500倍液的防治效果高于80%。说明在苗圃用吡唑醚菌酯1 000倍和1 500倍液防治杨树烂皮病,可以取得良好的防治效果。

杨树烂皮病菌颉颃菌株的初步筛选与分子鉴定

对杨树烂皮病菌的平板对峙试验结果表明,6种颉颃真菌中木霉的抑菌率最高为51%,而颉颃细菌4个菌株的抑菌率均在60%左右,说明颉颃细菌的抑菌效果明显高于颉颃真菌;对B137等4株颉颃细菌的分子鉴定认为,1株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),2株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),还有1株为苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt);解淀粉芽孢杆菌和苏云金杆菌对杨树烂皮病菌有较好的颉颃效果。

杨树烂皮型、水泡型溃疡病的药剂防治试验

以相关文献中药剂抑菌试验的结果为参考,选用7种常见杀菌剂,在天津汉沽地区针对烂皮型溃疡病较重的毛白杨和水泡型溃疡病较重的107杨开展药剂防治试验,防治前后分别进行病情调查,并对调查结果和防治成本进行了统计分析。防效分析结果表明:腐烂净(腐殖酸铜)、轮腐净(甲硫·福美胂)对烂皮型溃疡病防效最好,病情抑制率依次为75.33%,70.89%,且二者防效无显著差异(P>0.05);80%多菌灵可湿性粉剂和轮腐净(甲硫·福美胂)对水泡型溃疡病防效最好,病情抑制率依次为72.00%,68.44%,且二者防效无显著差异(P>0.05)。防治成本分析表明:不包含病斑刮除的人工费用(80元·百株-1),腐烂净(腐殖酸铜)和轮腐净(甲硫·福美胂)成本最低,分别为44.6元·百株-1和51.5元·百株-1,80%多菌灵可湿性粉剂成本较高,达到73.5元·百株-1。综合考虑防治效果和经济效益,轮腐净(甲硫·福美胂)是防治两种类型溃疡病的最优选择。

黑杨派杨树烂皮病早春症状观察

采取肉眼观察、病斑解剖和物候特征观测的方法研究黑杨派杨树辽育3号、108杨和中辽1号烂皮病的早春病斑症状。结果表明:3个杨树品种在早春均可观察到烂皮病的发病症状,且在病斑的表现上具有一定的差异,不同时期症状也不同。3个杨树品种在4月中下旬均可见到韧皮部黑色坏死或深棕色坏死,且108杨和中辽1号发生丝状腐烂现象。烂皮病病斑在韧皮部的坏死范围均要大于病斑表面的坏死范围。不同时期叶芽和嫩枝颜色的变化可作为鉴别病害发生时期的物候特征。

杨树烂皮病对湖北地区杨树的危害风险

杨树烂皮病是湖北地区近年来危害性上升迅速的林业有害生物,其主要寄主在湖北种植广泛。其病原金黄壳囊孢菌Cytospora chrysosperm侵染杨树枝干部,从而导致死亡。依据林业有害生物风险分析指标体系,采用多指标综合评价法对杨树烂皮病危险性进行定量化分析和评判。结果表明,杨树烂皮病在湖北省的危害风险值为2.01,即:杨树烂皮病在湖北地区为中度危险性的林业有害生物。此结果将为我省应杨树烂皮病的综合防控技术研究提供基础科学依据。

景观复杂性和林分因素对两种土壤条件下杨树腐烂病发生的混合影响

【目的】本文探究了不同土壤条件下景观复杂性和林分因素对杨树腐烂病的影响机制,为合理配置景观格局从而有效控制杨树腐烂病提供理论依据,促进杨树人工林的可持续发展。【方法】于2018年和2019年分别调查了新疆维吾尔自治区克拉玛依市和玛纳斯县两种不同的土壤理化性质下杨树腐烂病的发病情况。通过建立广义线性混合效应模型(GLMMs),以年份为随机效应,在景观尺度上分析景观复杂性和林分因素对杨树腐烂病的发生影响。【结果】黑杨和新疆杨腐烂病的发生与林分密度和害虫的香农多样性指数呈显著正相关关系,黑杨腐烂病与第一活枝高有显著正相关关系。两种杨树的腐烂病的发生与非杨树寄主的比例,以及海拔高度呈负相关关系;腐烂病与土壤理化性质具有显著相关性,同一景观结构中,克拉玛依的病害发病率高于玛纳斯,而且同一土壤条件下,简单景观中腐烂病的发病率高于复杂景观。【结论】本研究表明可以通过样地管理和在景观尺度上增强树木抗性来降低杨树腐烂病的发病率,从而为森林有害生物的管理提供理论依据。在造林规划中要考虑周边的景观结构特征对有害生物的潜在影响。同时利用土地覆被数据长期有效地监管景观特征对杨树腐烂病的影响,可以达到改善经济和环境效益的目的。

杨树腐烂病菌(Cytospora chrysosperma)原生质体遗传转化体系的构建

【目的】通过分析不同酶解条件对金黄壳囊孢菌[Cytospora chrysosperma(Pers.)Fr.]原生质体释放的影响,建立高效制备原生质体及其遗传转化体系的方法,为开展杨树腐烂病菌的致病分子机制研究奠定基础。【方法】以杨树腐烂病菌菌株CFCC 89981为受体,在细胞壁降解酶作用下产生用于转化所需的原生质体,通过PEG(Polyethylene glycol)介导将g GFP DNA导入杨树腐烂病菌的原生质体中获得转化子。经PCR扩增、Southern blot和荧光观察验证g GFP DNA插入到杨树腐烂病菌基因组中并表达出GFP(Green fluorescent protein)蛋白。【结果】以p H 5.5的1.2 mol/L KCl为稳渗剂,杨树腐烂病菌菌丝经Driselase和Lysing enzymes共同酶解4 h可获得1.2×108个/m L原生质体,再生率可达63.74%±9.73%,FDA(Fluorescein diacetate)溶液染色结果显示98%左右的原生质体具有较高的活力。利用PEG介导的遗传转化方法,转化效率可达76个/μg DNA。PCR检测和Southern blot均可在转化子基因组中检测到GFP基因片段,且荧光检测转化子的菌丝均呈绿色荧光,表明GFP基因在杨树腐烂病菌中表达。此外,GFP转化子在无潮霉素抗性的PDA培养基中多代转接后仍稳定遗传并表达GFP蛋白。【结论】通过筛选酶解条件,获得高质量、高活性的杨树腐烂病菌原生质体,并利用PEG介导的转化方法建立了高效稳定的原生质体遗传转化体系。该体系的建立为杨树腐烂病菌的后续研究奠定了技术基础。