淋病奈瑟菌孔蛋白PorB的原核表达及其在疫苗血清学检测中的初步应用

目的克隆并表达淋病奈瑟菌孔蛋白Por B,以重组蛋白为抗原,间接ELISA检测免疫血清的抗体水平。方法利用PCR从淋病奈瑟菌WHO株基因组中扩增出Por B的基因,克隆入原核表达载体p ET-30a中,构建出重组表达质粒p ET30aPor B,并转化大肠杆菌BL21(DE3)中,异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。表达的蛋白进行SDS-PAGE分析,Western blot检测其反应原性。以纯化的重组蛋白r Por B作为检测抗原建立间接ELISA方法,用于检测淋病疫苗p VAX1-Por B免疫小鼠后的血清抗体水平。结果 PCR扩增得到淋病奈瑟菌孔蛋白Por B基因,表达的重组蛋白r Por B相对分子质量约40 k D,经Ni-NTA亲和层析纯化后的r Por B在SDS-PAGE中显示单一条带,Western blot证明纯化后的r Por B可与淋病奈瑟菌免疫血清特异性结合,具有良好的免疫反应性。间接ELISA结果表明,淋病疫苗p VAX1-Por B免疫小鼠血清Por B特异性抗体滴度为1∶200。结论成功构建了重组原核表达质粒p ET30a-Por B,Por B在大肠杆菌中获得表达。以纯化的r Por B为检测抗原,间接ELISA可以用于淋病疫苗免疫效果的评价。该研究为淋病奈瑟菌感染诊断、疫苗的研究奠定了基础。

淋病奈瑟菌外膜蛋白PorB原核表达系统的构建及其序列分析

采用PCR技术扩增淋病奈瑟菌临床菌株的外膜蛋白PorB基因,并将其插入到原核表达载体pET42a多克隆位点中,构建重组表达载体.后经IPTG诱导,SDS-PAGE检测表达结果.结果表明,淋病奈瑟菌外膜蛋白PorB基因的原核表达系统构建成功,将为淋球菌诊断试剂盒及淋球菌疫苗的研究提供依据.

淋病奈瑟菌对头孢曲松的敏感性和porB基因特征分析

目的:了解某院分离出的淋病奈悬菌对头孢曲松的敏感性和PorB基因突变特征。方法:收集2019~2021年检出的共43株淋病奈瑟菌,并测定头孢曲松的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concent ration,MIC),利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR),扩增细菌的porB基固,对PCR产物进行Sanger测序,分析淋病奈瑟菌的PorB基因的突变情况。结果:43株菌株主要来自妇科、男科和泌尿外科门诊就诊患者的分泌物或脓液经培养鉴定所得,其中患者男36例(占83.7%)、女7例(占16.3%)。43株菌株均未发现对头孢曲松不敏感的情况。其中MIC≥0.031μg/mL的菌株有10株,占比23.3%。将MIC≥0.031μg/mL菌株进行porB基图的PCR扩增和测序分析显示,其中1栋菌株为PorB1a型;其余9株菌株为DorB1b型,与野生型菌株相比,这9株菌林在G120和/或A121的位置上共发现4种突变方式,分别为G120K/A121D(n=3)、G120K/A121N(n=3)、G120K/A121G(n=2)和G120R/A121D(n=1)。结论:POIB序列分析可以作为区分淋病奈瑟菌及其流行病学初步分析的有用工具之一。头孢曲松仍是治疗淋病奈瑟菌的有效抗生素。

淋病奈瑟菌外膜蛋白PorB的克隆表达与鉴定

目的 构建表达淋病奈瑟菌外膜蛋白PorB重组质粒 ,并在大肠杆菌中表达获得基因重组蛋白。方法 用PCR方法从淋病奈瑟菌WHO标准株E株基因组扩增出PorB基因片段 ,插入 pUCm T载体中 ,序列测定正确后 ,将其亚克隆到表达载体 pQE3 0中 ,进一步测序正确后在大肠杆菌M 15中表达。 结果 获得淋病奈瑟菌PorB蛋白基因 ,经序列测定与GenBank公布的序列同源性高达 99% ;表达蛋白经SDS PAGE分析 ,相对分子质量与预期大小一致 ;重组蛋白经Western印迹法鉴定 ,在 3 4kD位置有特异条带 ,PorB蛋白在宿主菌中高表达。结论 基因重组表达的融合蛋白将有利于进一步研究淋病奈瑟菌外膜蛋白PorB的功能 。

淋病奈瑟菌外膜蛋白PorB基因的克隆及原核表达

目的:构建淋病奈瑟菌外膜蛋白PorB的融合表达载体,并在原核系统中表达,获得基因重组蛋白,为进一步研究淋病奈瑟菌外膜蛋白的致病作用和免疫保护性提供基础。方法:根据PorB已知序列设计一对引物,用PCR方法从淋病奈瑟菌标准菌株NG 29403基因组DNA中扩增出PorB基因,与原核表达质粒pGEX-4T-1构建重组子pGEX-4T-PorB,并将重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞。重组子经酶切、PCR鉴定和核酸序列分析正确后,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白的表达,用SDS-PAGE及Western印迹进行鉴定。结果:限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明,扩增出了淋病奈瑟菌外膜蛋白1 047 bp的PorB基因,成功构建了重组质粒pGEX-4T-PorB,经SDS-PAGE及Western印迹分析显示重组质粒pGEX-4T-PorB在大肠埃希菌中得到了高效融合表达。结论:成功构建pGEX-4T-PorB原核表达载体,并在原核系统中得到了高效表达。

淋病奈瑟菌外膜蛋白PorB编码基因的克隆及序列分析

目的 获取淋病奈瑟菌外膜蛋白PorB编码基因 (porB)并构建其重组表达质粒。 方法 根据porB已知序列 ,设计合成一对引物 ,用PCR方法从淋病奈瑟菌基因组DNA中扩增出 porB基因片段 ,克隆到原核表达质粒 pQE3 0中 ,转化大肠埃希菌M15感受态细胞 ,经酶切和PCR鉴定 ,然后进行测序。 结果 porB基因体外扩增产物大小约为 911bp。重组质粒经双酶切和PCR鉴定表明为正确重组子 ,测序结果与已知序列基本吻合。 结论 成功克隆了淋病奈瑟菌外膜蛋白PorB编码基因 ,为下一步PorB蛋白的功能研究和淋病奈瑟菌蛋白质疫苗的研制提供了基本的物质基础。

淋病奈瑟菌临床菌株porB基因分型及其突变与耐药相关性研究

了解淋病奈瑟菌临床菌株porB基因型及其产物120和121位氨基酸突变与耐药的相关性。采用多重PCR(mPCR)检测淋病奈瑟菌临床菌株porB基因型,扩增产物测序后分析其编码蛋白的120和121位氨基酸突变情况,二倍平皿稀释法检测临床菌株对青霉素和四环素的耐药性。184株淋病奈瑟菌临床菌株中,99.5%(183/184)检出porB基因,其中61株(33.3%)为porB1A基因型,122株(66.7%)为porB1B基因型。122株porB1B基因型菌株中,117株(95.9%)porB基因120和/或121位氨基酸发生突变,5株(4.1%)porB1B及所有porB1A基因型菌株porB基因120和/或121位氨基酸未突变。117株porB基因120和/或121位氨基酸突变的porB1B基因型菌株中,97.4%(114/117)和95.7%(112/117)分别对青霉素和四环素耐药,2.6%菌株(3/117)对青霉素和四环素敏感。61株porB1A基因型菌株中,仅有2株(3.3%)对青霉素和四环素耐药。研究中采用的mPCR能快速、准确地对淋病奈瑟菌临床菌株porB基因进行分型,这些菌株主要携带porB1B基因且该基因型菌株对青霉素和四环素耐药率显著高于porB1A基因型(P<0.01),该耐药性与porB1B基因120和/或121位氨基酸突变密切相关。

重组脑膜炎球菌PorB蛋白对猪伪狂犬弱毒疫苗的免疫增强效力

探讨原核表达的重组脑膜炎球菌外膜蛋白PorB对猪伪狂犬弱毒活疫苗免疫的增强效果。将Gen Bank公布的脑膜炎球菌外膜蛋白PorB基因克隆到原核表达载体pQZⅢ中,命名为pQZ-PorB质粒,转入大肠杆菌BL21中表达重组蛋白。采用SDS-PAGE、Western-blot技术和Ni^(2+)-NTA柱鉴定并纯化重组蛋白。将每份含100μg剂量的重组PorB蛋白与猪伪狂犬弱毒疫苗混合后分别滴鼻免疫3日龄仔猪和肌肉注射免疫50日龄猪,同时设PBS对照组和免疫前对照组。免疫28 d后测定IgG和IgA抗体水平、猪外周血淋巴细胞增殖情况以及细胞因子(IFN-γ、IL-10、IL-6)的表达水平。SDS-PAGE和Western-blot结果表明,PorB基因在大肠杆菌中表达,表达的重组PorB蛋白是可溶性的,Ni^(2+)-NTA柱能够有效纯化重组蛋白。重组PorB蛋白不但能够刺激免疫猪在较短时间内产生的较高血清IgG抗体、黏膜IgA抗体和中和抗体,而且可以通过诱导机体产生IFN-γ和IL-6来促进细胞免疫反应。在猪伪狂犬弱毒疫苗免疫中,重组PorB蛋白可以作为一种优良的免疫增强剂。

淋球菌孔蛋白PorB致病机制研究进展

奈瑟菌属孔蛋白作为免疫佐剂在B细胞和其他抗原提呈细胞活化中发挥作用。PorB能镶嵌在宿主细胞膜和线粒体膜上,引起线粒体一系列变化,导致宿主细胞发生病变。PorB通过TLR2转导其效应,可与补体抑制剂C4b结合蛋白结合,拮抗补体介导的杀伤作用。PorB活化细胞的转录因子NF-κB,可增加宿主细胞抗凋亡因子的表达。淋球菌PorB作为主要外膜蛋白,其致病性一直都是国内外研究的热点。

我国脑膜炎奈瑟菌孔蛋白PorA、PorB的多态性分析

目的以蛋白质组学研究为基础，分析2003-2005年我国流脑暴发流行期间C群脑膜炎奈瑟菌菌株特征，建立以致病性相关蛋白多态性为目标的新分型方法。方法利用双向电泳和MALDI-TOF质谱鉴定分析2003-2005年流脑流行期内分离的66株C群脑膜炎奈瑟菌菌株及2株参考菌株的蛋白表达，重点分析与致病性相关的蛋白多态性特征。结果根据孔蛋白PorA、PorB在双向电泳中的多态性，建立了12个特征菌型。安徽菌株的PorA和PorB蛋白电泳谱型显示出了高度的一致性，而其他地区的菌株则显示出高度的多态性。结论PorA和PorB蛋白2-DE电泳谱型可以作为一种新的菌株分型方法，可能在菌型变迁检测和流脑暴发预警中具有重要应用前景。

4株脑膜炎球菌菌株的16SrRNA、PorA和PorB基因序列分析

目的对A、C、Y和W135 4个不同血清群脑膜炎球菌菌株的16SrRNA、PorA和PorB基因进行序列分析，从分子水平对其做出鉴定。方法提取脑膜炎球菌基因组DNA为模板，设计特异性引物进行16SrRNA、PorA和PorB基因的PCR扩增并测序。结果A、C、Y和w135 群4个菌株的16SrRNA基因序列与GenBank中奈瑟菌属的脑膜炎球菌的同源性最高。4个菌株的PorA基因分型分别为P1．5—2，10；P1．7-1，1；P1．5-1，2—2；P1．5，2。PorB基因分别与porB3—26、porB2—40、porB3—100和porB3—25同源。结论从基因水平分析表明4个菌株属于脑膜炎球菌，并在PorA和PorB基因分型上有差异。

淋病奈瑟菌临床菌株porB基因分型及其突变与耐药相关性研究

目的:分析本地区淋病奈瑟菌临床菌株porB基因分型特点及其Gly120和Ala121突变与耐药性关系。方法:多重PCR扩增非产酶淋病奈瑟菌临床菌株porB基因、测序分析Gly120和Ala121突变,并与药敏试验比较。结果:154株非产酶淋病奈瑟菌临床菌株中,porB1A型和porB1B型临床菌株分别占29.9%和70.1%。porB1A型菌株均出现Gly120Asp/Ala121Gly双突变,对青霉素和四环素的耐药率分别为15.2%和10.9%;95.4%porB1B菌株存在出现Gly120和/或Ala121突变,耐药率分别为99.1%和97.2%,其中4株porB1B菌株121和122位氨基酸存在删除突变的菌株对青霉素和四环素的MICs分别高达为8 mg/L～16mg/L和8 mg/L。结论:建立的多重PCR可用于淋病奈瑟菌porB基因分型。本地区流行的非产酶淋病奈瑟菌主要携带porB1B基因,不同基因型临床菌株对抗生素的耐药率有显著性差异(P<0.05)。Gly120和/或Ala121突变增强耐药性仅限于porB1B菌株。

淋病奈瑟菌外膜蛋白PorB二级结构及其B细胞和T细胞表位分析

目的分析淋病奈瑟菌外膜蛋白PorB的二级结构及其潜在的优势B细胞和T细胞抗原表位。方法应用在线工具TMHMM对PorB全长氨基酸序列进行跨膜区域分析,利用EXPASY服务器上的GOR4和SOPMA工具预测PorB的二级结构,通过DNAStar软件Protean模块的Karplus-Schulz、Kyte-Doolittle、Emini方法和Jameson-Wolf方法分析PorB蛋白的柔韧性、亲水性、表面可及性和抗原性,以综合预测其优势B细胞表位。选择常见的HLA基因型,并兼顾小鼠H2-Ed、Ek限制性,利用SYFPEITHI软件以多肽氨基酸是否为锚定残基、辅助残基或优势残基进行记分,选择得分高的肽段作为候选T细胞表位,采用NetMHC-Ⅱ软件以肽段分子与MHC分子的亲和力为依据,判断肽段的抗原性,综合SYFPEITHI和NetMHC-Ⅱ软件分析结果以确定T细胞抗原表位存在的可能区域。结果 PorB蛋白的N端第1-20氨基酸为跨膜区,第20以后的氨基酸则位于膜外;PorB的二级结构以无规则卷曲为主,亦可见α螺旋和β折叠;根据其柔韧性、亲水性、表面可及性和抗原性特征综合分析,PorB优势B细胞表位可能存在于氨基酸序列N端的第165-175,195-206,236-243,275-282肽段;SYFPEITHI和NetMHC-Ⅱ软件预测出T细胞优势表位可能位于第18-32、126-142和186-200肽段。结论应用生物信息学方法分析PorB蛋白的T细胞和B细胞优势表位可能分别是第18-32、126-142和186-200肽段,165-175,195-206,236-243,275-282肽段,为淋球菌表位疫苗的研制提供了思路和理论依据。

淋菌孔蛋白PorB原核表达与抗原表位及保守性分析

目的构建淋菌PorB原核表达载体以制备PorB重组蛋白,并分析其B淋巴细胞抗原表位及在不同血清型淋菌菌株中的保守性,以评价其作为淋菌候选蛋白疫苗的可行性。方法以淋菌标准菌株基因组DNA为模板,利用PCR技术扩增出PorB基因,并构建原核表达载体ppSUMO-PorB,酶切鉴定成功后转化至大肠埃希菌BL21（DE3）,经IPTG诱导后行SDS-PAGE,检测蛋白表达情况;从Genebank中找出不同淋菌血清型的PorB蛋白质氨基酸序列,并用ClustalX 2.1软件分析其序列保守性,DNASTAR软件预测其B淋巴细胞抗原表位。结果大肠埃希菌BL21（DE3）有PorB蛋白表达,并以包涵体表达形式存在;PorB蛋白在不同血清型淋菌菌株间具有较高的保守性（达95.7%）,PorB蛋白的B淋巴细胞抗原表位主要位于152～157、166～179、201～216、246～253、260～267、295～303、311～318等氨基酸区段。结论成功构建ppSUMO-PorB原核表达载体,并在原核系统中得到了包涵体形式的PorB蛋白,且该蛋白保守性高,可以作为淋菌蛋白疫苗候选靶点。

乳糖发酵菌PorB孔蛋白可在小鼠中诱导对卵清蛋白的Th1和Th2免疫应答

致病性奈瑟菌孔蛋白对人体和动物均具有免疫佐剂活性，通过Toll样受体信号激活APC。非致病性奈瑟菌孔蛋白具有与致病性奈瑟菌孔蛋白相似的结构和功能。美国波士顿大学医学院Liu等对共生乳糖发酵菌孔蛋白（Nlac PorB）对免疫系统的佐剂效果及其作用机制进行了研究。

不同佐剂与鼠疫F1-V融合重组蛋白抗原滴鼻免疫效果的研究

目的研究不同佐剂与鼠疫F1-V融合重组蛋白抗原滴鼻免疫Balb/c小鼠,观察机体产生体液免疫和局部粘膜免疫反应的效果,为发展黏膜疫苗提供理论基础。方法鼠疫F1-V融合重组蛋白抗原按比例分别与PorB(2类外膜蛋白)重组蛋白、蛋白体佐剂制备黏膜疫苗,滴鼻免疫Balb/c小鼠3次,取尾静脉血,采用ELISA检测血清IgG及抗体亚型分类,并检测鼻咽、肺、小肠及阴道灌洗液sIgA;采用FAC检测脾淋巴细胞表型的变化。结果PorB重组蛋白佐剂疫苗组和蛋白体佐剂疫苗组较无佐剂组体液免疫抗体水平高、蛋白体佐剂疫苗组好于PorB重组蛋白佐剂疫苗组,但无显著性差异。结论PorB重组蛋白佐剂疫苗和蛋白体佐剂疫苗均能诱导较强的系统免疫和黏膜免疫应答,且PorB重组蛋白佐剂疫苗免疫效果可与蛋白体佐剂疫苗相媲美,可进一步论证是否可用PorB重组蛋白佐剂替代蛋白体佐剂,这为鼠疫粘膜疫苗的研制奠定了基础。

大采高工作面搬家安装工艺探讨

通过对寺河矿投产以来大采高工作面设备搬家安装经验进行探讨,总结出一套可行的搬家工艺,可实现安全快速地转移大采高综采设备,充分发挥大采高综合机械化采煤的优越性,保证安全、经济、高产。

广东省珠海地区淋球菌多抗原序列分型研究

目的:了解广东省珠海地区淋球菌基因型的分布,为淋病的防控提供实验室依据。方法:采用淋球菌多抗原序列分型法(NG-MAST)对2018-2019年珠海市淋病监测网络收集的172株淋球菌菌株进行基因分型,并构建系统进化树。结果:172株淋球菌中,porB基因型82种,tbpB基因型44种;porB和tbpB基因型别前三位分别为por2978(13株)、por1135(11株)、por3215(9株)和tbp10(37株)、tbp21(26株)、tbp110(13株)。NG-MAST型别79种,未知基因型占33.7%,优势基因型为ST9659(9株)、ST5308(6株)、ST8140(6株),系统进化树显示菌株具有高度多态性。结论:本地区NG-MAST型别具有多样性,新基因型菌株较多。

打造超级安全的日志服务器

在现下越来越多的黑客高手出现的情况下，管理员如何确保日志的完整性呢?本文试图阐述如何打造超级安全的日志服务器，以飧广大网管商朋友们。

基于PROBE方法的DWFC内聚度量改进

利用有向带权伪图(Directed Weighted False Chart,DWFC)表示面向对象程序中类内部成员间的依赖关系,提出一种基于DWFC的面向对象类内聚度量方法,结合PSP(Personal Software Process)技术中PROBE(PROxy-Based Estimating)规模估算方法,改进了良好内聚度量方法的验证准则,并结合实验验证了该方法的优越性。