猪德尔塔冠状病毒双脯氨酸突变S蛋白的表达及免疫原性评价

【目的】猪德尔塔冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)是一种重要的猪肠道冠状病毒,给全球生猪养殖业带来了巨大的经济损失,截至目前,尚无可用的商品化疫苗。本研究选择宿主免疫反应主要诱因因子棘突(spike,S)蛋白,并将PDCoV S蛋白七肽重复序列1(heptapeptide repeat-1,HR1)与中心螺旋之间的环中855和856位点均突变为双脯氨酸(E855P和V856P),然后利用ExpiCHO-S真核表达系统表达、纯化重组S蛋白和双脯氨酸突变S蛋白(S2P)并评价其免疫原性及免疫保护性,以初步研制一种免疫效果较好的PDCoV亚单位疫苗。【方法】利用间接酶联免疫吸附法检测免疫小鼠血清特异性抗体IgG水平;利用血清中和试验检测免疫小鼠血清中和抗体滴度;通过流式细胞术检测免疫小鼠T淋巴细胞增殖情况;通过细胞因子检测免疫小鼠干扰素(interferon,IFN)-γ、IFN-α、白细胞介素(interleukin,IL)-2和IL-4等细胞因子分泌情况;采用RT-qPCR检测攻毒后小鼠肠道组织PDCoV病毒载量;采用病理组织切片检测小鼠肠道有无病理损伤;利用免疫组织化学检测小鼠肠道组织PDCoV抗原分布情况。【结果】免疫原性结果显示,小鼠在肌肉注射S组和S2P组亚单位疫苗后能够产生较高水平的抗PDCoV特异性IgG抗体,免疫后42 d的小鼠血清均对PDCoV具有中和作用,其中,S2P组对LLC-PK细胞50%中和保护效价显著高于S组。此外,S组和S2P组显著地诱导小鼠CD_(4)^(+)T淋巴细胞增殖,并且S2P组高于S组,而S2P组能够诱导小鼠CD_(8)^(+)T淋巴细胞增殖,但S组与PBS组并无差异。同时,S组和S2P组诱导的IFN-γ、IFN-α、IL-2和IL-4等细胞因子水平均显著高于PBS组,但S组和S2P组并无差异。免疫保护性结果显示,PBS组肠组织中可检测到PDCoV病毒,肠组织出现病理损伤且可见大量PDCoV抗原,而S组和S2P组未检测到PDCoV病毒且未观察到肠组织损伤,二者之间无明显差异。【结论】S2P组较之S组能够诱导小鼠产生更高水平的抗PDCoV体液免疫应答,两组疫苗对小鼠均有一定的保护效果,本研究为后续PDCoV亚单位疫苗研发奠定坚实的基础。