pAPN基因敲除的IPEC-J2介导的TGEV感染特征分析

旨在探究猪氨基肽酶N(porcine aminopeptidase N,pAPN)基因敲除的猪空肠上皮细胞系(intestinal porcine epithelial cell line J2,IPEC-J2)介导猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)感染的特征,为深入了解pAPN基因在TGEV感染过程中的作用机制提供理论依据。研究分为pAPN基因敲除IPEC-J2组(IPEC-J2-KO组)、野生型IPEC-J2组(IPEC-J2-WT组)和未接种TGEV的野生型IPEC-J2组(Mock组)3组,每组设置3个重复。首先通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)确定IPEC-J2接种TGEV毒株后收取细胞样品的最佳时间节点;其次,对IPEC-J2-KO进行了脱靶效应检测;然后,通过qPCR、蛋白免疫印迹(western blot,WB)、间接免疫荧光分析(indirect immunofluorescence assay,IFA)和50%组织细胞感染量(50%tissue culture infective dose,TCID_(50))对接种TGEV的IPEC-J2-KO、IPEC-J2-WT及Mock进行感染特征分析;最后,通过WB检测IPEC-J2-KO、IPEC-J2-WT和Mock中NF-κB p65及其磷酸化蛋白pp65的表达情况。qPCR结果显示,接毒24 h是收集细胞样本以评估TGEV对IPEC-J2影响的最佳时间节点;脱靶分析结果显示,在IPEC-J2-KO中未检测到脱靶效应;病毒感染特征分析结果显示,与IPEC-J2-WT相比,IPEC-J2-KO内病毒拷贝数、病毒滴度均极显著降低(P<0.001),与Mock相比,IPEC-J2-KO内病毒拷贝数、病毒滴度均无显著差异(P>0.05),且IPEC-J2-KO内未检测到TGEV-N蛋白的表达;此外,与Mock相比,接种TGEV后,IPEC-J2-WT组NF-κB p65的磷酸化水平极显著上调(P<0.001),而IPEC-J2-KO组无显著差异(P>0.05)。本研究表明,IPEC-J2-KO可有效抵抗TGEV的感染,接种TGEV未影响IPEC-J2-KO中先天免疫相关信号通路中转录因子NF-κB的活性。该研究为IPEC-J2作为TGEV感染特征研究的细胞模型提供了理论依据,为阐明pAPN基因在TGEV入侵宿主细胞的机制及抗病猪新品种的研究奠定了基础。

pEGFP-N1-pAPN-SPC段基因真核表达载体的构建及其在Vero细胞中表达

为了构建能够表达猪pAPN-SPC段的真核细胞表达载体pEGFP-N1-pAPN-SPC,并在Vero细胞中进行表达,本试验从猪肠道黏膜组织基因组中扩增出pAPN-SPC段基因,插到带有EGFP基因的真核细胞表达载体pEGFP-N1中,经Bam HⅠ及EcoRⅠ酶切鉴定正确后转染Vero细胞,用荧光显微镜检测细胞中EGFP的表达,用RT-PCR和Western blot检测pAPN-SPC段基因的表达情况。结果成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-pAPN-SPC,且pAPN-SPC段在Vero细胞中得到了有效表达,为研究pAPN-SPC段蛋白对病毒增殖效果的影响奠定了基础。

利用CRISPR/Cas9编辑系统构建pAPN基因敲除的IPI-2I细胞系

试验旨在采用CRISPR/Cas9技术获得猪氨基肽酶N(porcine aminopeptidase N,pAPN)基因敲除的猪回肠上皮(immortal pig intestinal-2I,IPI-2I)细胞系,进而在细胞水平上研究pAPN在冠状病毒入侵过程中的作用及相互作用机制。本研究将已构建好的靶向pAPN基因第2外显子上的2个sgRNA载体(pX330-GFP-g3和pX330-RFP-g5)共转染IPI-2I细胞。转染48 h后,荧光显微镜下观察IPI-2I细胞绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)和红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)的发光情况,并用流式细胞仪收集带有GFP和RFP荧光标记的细胞,用来筛选单克隆细胞。然后取少量单克隆细胞提取DNA,用PCR扩增打靶区域附近的序列,测序鉴定其基因型,以获得pAPN基因敲除的IPI-2I细胞株。选择野生型和pAPN基因纯合片段敲除的IPI-2I细胞,提取细胞总蛋白,通过Western blotting检测pAPN基因敲除前后IPI-2I细胞中pAPN蛋白的表达。结果表明,转染48 h后,通过荧光显微镜可以观察到IPI-2I细胞中大部分细胞能够同时表达GFP和RFP,说明pX330-GFP-g3和pX330-RFP-g5质粒载体已经转入IPI-2I细胞。PCR和测序结果表明,共获得48株片段敲除单克隆细胞(片段敲除效率为15.5%),其中16株为单等位基因敲除,32株为双等位基因敲除;在32株双等位基因敲除细胞中,有23株细胞为纯合片段敲除。Western blotting结果表明,pAPN基因纯合片段敲除的细胞中检测不到pAPN蛋白的表达。综上,本研究利用CRISPR/Cas9编辑系统成功构建了pAPN基因纯合敲除的IPI-2I细胞系,为阐明pAPN在冠状病毒入侵过程中的作用机制以及制备猪抗病新品种奠定了基础。

猪氨基肽酶N病毒结合受体核心区对TGEV在ST细胞中复制影响的研究

为研究与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)结合的猪氨基肽酶N(pAPN)受体核心区对TGEV复制以及细胞功能的影响,本研究检索并分析pAPN与TGEV的结合位点,结果显示,敲除pAPN aa668~aa963对其酶活性无影响。因此,利用CRISPR/Cas9技术构建pAPN与TGEV结合位点敲除细胞系,经PCR和western blot鉴定结果显示,正确构建一株敲除pAPN aa668~aa963的ST细胞系,即敲除pAPN 15-21外显子,命名为KO-ST-15。采用CCK-8和细胞划痕方法检测KO-ST-15细胞的增殖和细胞迁移活性,结果显示,敲除pAPN 15-21外显子对ST细胞增殖和迁移活性均无显著影响。利用RT-qPCR和IFA检测KO-ST-15感染TGEV后病毒复制拷贝数和N蛋白的表达,结果显示,敲除pAPN 15-21外显子可极显著抑制TGEV在ST细胞系中的复制(P<0.001)。利用RT-qPCR检测KO-ST-15感染TGEV后炎症相关基因转录水平变化,结果显示,TGEV感染后KO-ST-15中的IL-6、IL-8和NLRP3(NOD-like receptor protein 3)mRNA转录水平无显著变化,但RIG-I和MDA5的转录水平显著上调(P<0.05)。上述结果首次表明,敲除pAPN15-21外显子能够极显著抑制TGEV在ST细胞中的复制,但细胞KO-ST-15的正常生理功能无变化,TGEV不能进入敲除pAPN 15-21外显子的细胞中引起炎症反应,该结果为进一步培育抗病育种猪提供参考依据和候选方案。

猪传染性胃肠炎病毒特异性受体APN功能区的初步鉴定

试验为了构建猪氨肽酶N（pAPN）不同基因片段大小的重组质粒并进行原核表达及纯化，经Western—blot、ELISA方法初步鉴定猪氨肽酶N受体功能区。试验构建重组了质粒pET30a—pAPN1（106～669nt）、pET30a—pAPN2（670-1044 nt）、pET30a—pAPN3（1045-1773nt）、pET30a—pAPN4（1774～2328 nt）、pET30a—pAPN5（2329—2889 nt）、pET30a—pAPN6（106—1044nt）、pET30a—pAPN7（1774—2889 nt）；转化宿主菌BL21（DE3）细胞，IPTG诱导表达蛋白，包涵体经SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳回收纯化；用Western—blot、ELISA方法经抗pAPN多克隆抗体初步筛选出pAPN受体功能区。结果表明：pET30a—pAPN2、pET30a—pAPN3、pET30a—pAPN6、pET30a—pAPN7蛋白均以包涵体形式表达并纯化。pET30a—pAPN3、pET30a-6、pET30a-7能与抗pAPN多抗产生特异性反应。经抗pAPN多抗筛选初步鉴定出其主要抗原功能区在36—153aa、349—591aa、592～963aa内。

猪氨肽酶N基因的克隆、表达系统构建和鉴定

为探讨猪氨肽酶N(APN)作为产肠毒素性大肠杆菌F4ac的受体蛋白的可能性,根据GenBank上的猪APN mRNA序列设计合成特异性引物,从新鲜的猪小肠组织中提取总RNA并反转录成cDNA第一链,RT-PCR扩增猪APN全长基因,并分别构建真核表达和原核表达系统。结果表明:APN基因已正确插入pcDNA3.1真核表达载体和pET-28a(+)原核表达载体,SDS-PAGE结果证明重组蛋白为包涵体,且纯化产物在110ku处有单一明显条带。pcDNA3.1-APN和pET28a-TAPN双系统的成功构建以及APN蛋白的成功表达,为进一步研究和验证该蛋白作为猪F4ac受体候选蛋白的可能性奠定基础。

巴马香猪氨基肽酶N截短基因的克隆与原核表达

为获得猪流行性腹泻病毒(PEDV)受体猪氨基肽酶N(pAPN)抗原,提取巴马香猪小肠绒毛上皮的总RNA,PCR扩增获得pAPN基因的主要抗原区片段,并将其克隆至原核表达载体pET-32a中,将重组质粒pET-32a-pAPN转化大肠埃希菌BL21,通过不同浓度的IPTG、不同诱导时间进行诱导表达,以确定目的蛋白表达的最佳条件。经SDS-PAGE和抗组氨酸标签的单抗进行Western blot检测重组蛋白在大肠埃希菌中的表达,结果显示,原核表达产物在诱导温度37℃、IPTG浓度为0.8mmol/L,诱导4h可获得最佳表达,产物分子质量约为45ku,获得的目的蛋白大小与预期一致。

生物信息学软件预测猪氨基肽酶N功能与结构

[目的]研究猪δ冠状病毒(PDCoV)入侵宿主细胞的感染机制,对其特异性受体猪氨基肽酶N基因编码蛋白功能与结构进行分析。[方法]通过多种生物信息学软件对pAPN蛋白的理化特性、亲疏水性、信号肽、跨膜区、糖基化位点、抗原表位、功能结构域及结构特征等进行预测分析。[结果]pAPN基因总长为2892 bp,编码963个氨基酸;其中,第35~963位氨基酸为膜外蛋白区,不含信号肽但包含2个典型的功能结构域。pAPN蛋白共有23个糖基化修饰位点和42个抗原表位。pAPN蛋白胞外域空间结构为二聚体,每个单体均可分为Ⅰ~Ⅳ4个结构域。[结论]该研究为了解pAPN蛋白与多种猪肠道冠状病毒相互作用的机制提供了思路。

人氨基肽酶N在猪丁型冠状病毒感染HEK293细胞中的作用

以HEK293细胞为模型,探讨人氨基肽酶N(human aminopeptidase N,hAPN)在猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)入侵人源细胞中的作用。RT-qPCR/RT-PCR鉴定PDCoV在HEK293细胞上的增殖情况,再用CRISPR/Cas9技术构建敲除hAPN基因的HEK293细胞系,通过CCK-8试验验证敲除细胞和野生型细胞的细胞活性;用RT-qPCR和Western blot检测hAPN敲除和过表达对PDCoV复制的影响;进一步通过同源建模和分子对接预测PDCoV S蛋白和hAPN蛋白的结合位点。结果显示:PDCoV在感染HEK293细胞后12~36 h快速增殖,在36 h达到顶峰,在HEK293细胞上至少可传至2代;hAPN敲除细胞与野生型细胞的细胞活性无明显差异,细胞敲除hAPN可显著抑制PDCoV复制,细胞过表达hAPN可促进PDCoV复制;同源建模和分子对接表明,S1蛋白可与hAPN蛋白结构域II结合,主要是S1蛋白的受体结合基序1(receptor binding motif 1,RBM1)氨基酸残基TYR^(92)、THR^(51)、THR^(48)、PHE^(16)和MET^(14)通过氢键与hAPN蛋白的氨基酸残基PHE^(490)、GLN^(531)、ARG^(528)和SER^(529)结合。hAPN在PDCoV感染人源细胞中发挥重要作用,为深入研究PDCoV的细胞入侵和跨种传播机制提供了新的理论依据。

猪流行性腹泻病毒的研究进展

猪流行性腹泻是一种急性、接触性、高度传染性消化道疾病,近年来给我国养猪业带来巨大经济损失。本文就近年来国内外对猪流行性腹泻病毒的研究进展(包括猪流行性腹泻病毒的结构蛋白和非结构蛋白、病毒的细胞培养特点、病毒感染的宿主受体、遗传变异和疫苗的开发等)进行综述,以期为猪流行性腹泻的预防和控制提供帮助。

慢病毒载体介导稳定表达pAPN的Vero细胞系的构建及应用

将完整的pAPN序列通过同源重组克隆入慢病毒表达载体pLVX-mCherry,并将该重组质粒pLVX-mCherry-pAPN与慢病毒包装质粒pLP1、pLP2、pLP-VSVG共转染293T细胞,在293T细胞中包装成含目的基因的重组慢病毒。将收获的重组病毒感染Vero细胞,经过嘌呤霉素筛选和细胞有限稀释法,筛选出表达pAPN的细胞。通过RT-PCR和间接免疫荧光试验(IFA)证明了所获细胞株能够稳定表达pAPN蛋白,命名为Vero-APN-B6。IFA试验和TCID50试验结果表明:与Vero细胞相比,Vero-APN-B6更能促进猪流行性腹泻病毒(PEDV)的增殖。利用该细胞株成功地从猪小肠组织中分离到了PEDV SC-MS株;经过鉴定该毒株为变异毒株。

猪流行性腹泻病毒细胞受体研究进展

猪流行性腹泻病毒主要引起仔猪腹泻,发病率及病死率极高,严重影响养猪业的发展。而猪流行性腹泻病毒要感染仔猪,必须与宿主细胞表面的受体结合。目前已有研究证实,猪流行性腹泻病毒的细胞表面受体为猪氨基肽酶N(pAPN)。为了能更好的揭示pAPN在病毒感染过程中的机制,学者针对pAPN的结构、功能以及与病毒的感染结合区域进行了系统的研究,并开展了筛选pAPN结合短肽的工作,以此来探索病毒受体的阻断剂。为进一步研究猪流行性腹泻病毒感染机制及其细胞受体的作用提供参考,论文就目前pAPN最新研究进展进行了综述。

猪流行性腹泻病毒入侵细胞的研究进展

猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)对新生仔猪危害极大,致死率可达90%,该病毒的变异株自2010年在中国乃至世界大规模暴发后,给养猪业造成巨大经济损失,本文总结了PEDV进入宿主细胞的研究进展,包括PEDV S蛋白在病毒入侵中的作用,以及PEDV在入侵过程中猪氨基肽酶N和唾液酸的作用,以此为PEDV致病机理的研究和该病防控提供基础和思路。

猪氨肽酶N多抗血清的制备及活性分析

为进一步研究猪氨肽酶N(pAPN)介导TGEV与靶细胞相互作用的机制,将编码猪氨肽酶N成熟肽基因(105～2889bp)克隆至原核表达载体pET-30a,将重组质粒pET-30a-pAPN转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后进行SDS-PAGE分析,利用蛋白切胶纯化技术对目的蛋白进行纯化,制备其多抗血清,并通过琼扩试验、Western-blot分析、病毒抑制试验及体外瞬时转染试验分析该多抗血清的生物活性。结果,获得了大小为112ku的目的蛋白,多抗血清效价为1∶32,该血清在低浓度时仍具有抑制病毒的活性。结果证实,制备的多抗血清具有较高的抗体效价、较强的特异性及良好的生物活性。