PEDV、TGEV与PDCoV S蛋白表位基因三联疫苗的构建及其鉴定

[目的]构建一种同时预防猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)的三联表位疫苗,以预防上述病原导致的猪的相关疾病。[方法]本研究运用免疫信息学在线软件对3种猪肠道冠状病毒(SeCoVs)的S蛋白B、T细胞表位进行预测分析,构建新的表位肽段,命名为PPT,通过ExPASy、VaxiJen、TMHMM、SOPMA、SOLpro和AlphaFlod2等在线软件对PPT进行生物信息学分析,并利用C-IMMSIM在线软件对其免疫反应进行模拟。通过T2A将PPT与PEDV的COE序列、TGEV的SAD序列及PDCoV的CTD序列连接并构建至真核表达载体pEGFP-N1,经PCR和双酶切鉴定正确后,将获得的重组质粒转染HEK293A细胞,经DAPI染色、CCK8、RT-PCR及Western blotting试验验证重组质粒在体外表达情况。[结果]构建的表位蛋白PPT由17条表位肽段组成,经生物信息学软件分析,该蛋白为非跨膜蛋白,结构稳定,具有抗原性和可溶性,亲水性高,无过敏性。C-IMMSIM结果显示,PPT能引起机体树突状细胞(DC)增加,B、T细胞免疫反应,刺激免疫球蛋白IgG、IgM和细胞因子γ-干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)水平升高。重组质粒经PCR和双酶切鉴定结果显示,分别在3359、2375、1064、944、764和467 bp出现特异性目的条带,与预期相符;重组质粒转染HEK293A细胞后,可见绿色荧光;RT-PCR扩增分别在3359、2375、1064、944、764和467 bp处获得与目的基因大小相符的条带;CCK-8检测结果表明,重组质粒对细胞均无明显毒性作用;Western blotting检测结果显示,分别在31.7、16.1、37.9和27.5 ku处出现与目的蛋白分子质量大小一致的条带,重组质粒成功在HEK293A细胞中表达。[结论]本研究基于计算机软件分析设计的PPT表位蛋白成功构建三联疫苗,且在体外表达,为评价PEDV-TGEV-PDCoV三联表位疫苗的免疫效果提供依据。

猪肉及制品中HEV、PEDV和PDCoV三重qPCR方法的建立与应用

人兽共患病引发的动物源性食品安全事件频发,为从食品原料源头上控制和保障其食用安全,控制猪肉及其制品消费成本,本研究构建了可同时检测猪肉及制品中戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)、猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)和猪δ冠状病毒(Porcine delta corona virus,PDCoV)三重实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative PCR,qPCR)方法。结果表明,三重qPCR方法只能扩增出3种目的病毒的特异性基因片段,特异性好;对HEV、PEDV和PDCoV三种病毒的最低检测限分别为6.02、6.98、6.92 copies/μL;组内和组间变异系数(CV%)在0.10%~3.00%之间,重复性好。将所建立方法应用于248份出口猪肉及制品和282份生猪粪拭子的检测,同时以相应病毒标准检测方法进行平行检测,结果显示猪肉及制品中三种病毒的检出率均为0%,与标准方法检测结果一致。生猪粪拭子中,该方法对PEDV、PDCoV和HEV三种病毒的检出率分别为1.06%、3.19%、0.35%,标准方法检出率分别为1.06%、3.19%、0%。研究表明,建立的三重qPCR检测方法能准确快速地检测猪肉及制品或生猪样品中三种病毒,为保障生鲜猪肉及其制品市场流通和阻断病毒食源性传播提供技术支持。

PDCoV与TGEV双重实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

试验旨在建立快捷、高效而准确的鉴别诊断猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)与传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)的双重实时荧光定量PCR方法。通过绘制双重实时荧光定量PCR的标准曲线,检验该方法的特异性、敏感性和重复性,并对临床样品进行检测。结果显示,双重实时荧光定量PCR方法的循环阈值与PDCoV和TGEV质粒拷贝数的对数之间存在良好的线性关系,且对应的相关系数分别为R2(P)=0.9994和R2(T)=0.996;能特异性地检测PDCoV和TGEV,而与PEDV、PRV、PRRSV、CSFV和RV无交叉反应,具有较强的特异性;检验PDCoV与TGEV质粒标准品的最低检测限度分别达到2和20拷贝/μL,且分别比常规RT-PCR高1000和100倍,具有较高的敏感度;PDCoV与TGEV的批内和批间重复性检测的Ct均值基本相同,且变异系数(CV)均<2%,具有较好的重复性。用该方法对114份仔猪腹泻样品检测结果显示,PDCoV和TGEV的阳性率分别为5.6%(6/114)和8.8%(10/114),混合感染检出率为4.6%(5/114),比常规RT-PCR具有更高的检出率和敏感性。结果表明,本试验建立的双重实时荧光定量PCR方法具有特异性强、灵敏度高、重复性和稳定性好等优点,适用于病毒早期诊断和批量临床样品检测,为疾病防控、流行病学调查及相关性研究提供了技术支持及数据参考。

猪δ冠状病毒RBD蛋白在昆虫细胞中的表达

为了获得具有天然构象且反应原性良好的猪δ冠状病毒((PDCoV))受体结合域(RBD)蛋白,根据PDCoV流行株CC-HN2K-02株S蛋白编码序列,筛选、设计、优化并合成其RBD段DNA序列,将其亚克隆至杆状病毒双表达载体pFastBac^(TM) Dual上,获得pFBD-PDR重组质粒。将该重组质粒转化到DH10Bac^(TM)大肠杆菌感受态细胞中,进行2轮蓝白斑筛选并进行PCR鉴定获得阳性重组杆状质粒Bacmid-PDR;通过脂质体转染SF9细胞进行病毒拯救,出现明显病变后收取上清,并在正常SF9细胞中盲传3代,获得的杆状病毒命名为rBV-PDR。利用间接免疫荧光法(IFA)和Western blot检测rBV-PDR感染昆虫细胞后的蛋白表达情况。结果:重组质粒pFBD-PDR酶切验证正确,重组杆粒Bacmid-PDR构建成功,杆状病毒中能够表达PDR蛋白且能与Sterp-tag抗体发生特异性结合,IFA鉴定出特异性红色荧光,表明本试验成功表达了PDCoV-RBD蛋白,为深入开展PDCoV抗体的制备、新型疫苗、诊断试剂研发奠定了基础。

新发猪Delta冠状病毒和猪流行性腹泻病毒SYBR GreenⅠ双重荧光RT-PCR检测方法的建立及应用

猪Delta冠状病毒（porcine delta coronavirus，PDCoV）是一种新发现的仔猪腹泻类冠状病毒，感染仔猪主要表现出水样腹泻、呕吐和脱水等临床症状，和猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，PED）临床症状极其类似，且I临床上混合感染病例较多，单靠临床症状和剖检变化很难辨别这2种疾病，因此建立同时检测且能区分PDCoV和PEDV的检测方法具有重要意义。参照GenBank登录的PDCoVM基因和PEDVORF3基因特异性序列设计引物，扩增相应的基因片段，克隆构建重组质粒pMD-18T—PDCovM与pMD-18T—PEDVORF8，测序验证后，分别以此重组质粒为标准品，建立了能同时检测PDCoV和PEDV的SYBRGreenI双重荧光RTPCR方法，并对其扩增体系和扩增条件等进行了优化，同时对所建立的双重荧光RT—PCR方法的特异性、灵敏性和重复性进行了检测。结果显示，该试验成功建立了能同时检测PDCov和PEDv的SYBRGreenI双重荧光RTPCR方法，最低能检测到PDCoV和PEDV分别是28．6拷贝/μL和99．6拷贝/μL的质粒浓度，显示出较好的敏感性；在同样扩增条件下该方法具有较好的重复性；特异性试验表明，该方法仅能检测出PEDV和PDCoV，而对猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒2型（PCV2）和猪伪狂犬病毒（PRV）等均不产生特异性扩增曲线。将所建立的双重荧光RTPCR方法以及单重荧光定量RT—PCR方法分别对198份临床收集的仔猪腹泻样品进行PEDV和PD—CoV检测，结果显示，PDCoV阳性样品41份，阳性率为20．7％；PEDV阳性样品59份，阳性率为29．8％；同时感染这2种病毒的样品17份，阳性率为8．6％。与单重荧光定量RT—PCR方法对PEDV和PDCoV的检出率一样，符合率100．0％。本研究成功建立了PDCoV和PEDV的双重荧光RT—PCR方法，能同时准确地检测PDCoV和PEDV，这为PDCoV和PEDV的临床鉴别诊断和流行病学调查研究奠定基础。

3种猪腹泻相关病原核酸液相芯片检测方法的建立

为建立同步检测猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪Delta冠状病毒(porcine delta coronavirus,PDCoV)3种腹泻相关病原体的快速高通量检测方法,本研究利用Lumeinex技术原理,建立三重液相芯片方法。结果显示,该方法可准确检出TGEV、PEDV和PDCoV 3种猪腹泻病原,与猪轮状病毒、口蹄疫病毒、水疱性口炎病毒、非洲猪瘟病毒等常见猪病病原无交叉反应;三重液相芯片方法对TGEV、PEDV和PDCoV核酸的检测灵敏度分别为33.2 pg/μL、163 pg/μL和12.1 pg/μL。应用该方法与荧光RT-PCR方法对52份临床样品同时检测,结果符合率为100%。研究结果表明,所建立的三重液相芯片方法可准确检测TGEV、PEDV和PDCoV,具有良好的特异性和敏感性。