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PEDV、PoRVA和PDCoV TaqMan三重RT-qPCR检测方法的建立与初步应用 被引量:1
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作者 胡泽奇 李润成 +5 位作者 谭祖明 谢秀艳 王江平 秦乐娟 李荣 葛猛 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第5期2267-2272,共6页
旨在建立一种可快速同时检测猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)、猪A群轮状病毒(porcine rotavirus type A, PoRVA)和猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus, PDCoV)三重荧光定量PCR方法。针对PEDV-N、PoRVA-... 旨在建立一种可快速同时检测猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)、猪A群轮状病毒(porcine rotavirus type A, PoRVA)和猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus, PDCoV)三重荧光定量PCR方法。针对PEDV-N、PoRVA-VP6和PDCoV-M基因设计了引物和探针,条件优化后进行性能评估,并与商品化试剂盒检测对比。结果显示:本研究建立的三重RT-qPCR方法具有良好特异性,对PRRSV、PCV_2和PRV等阳性核酸不发生扩增;具有较高的敏感性,PEDV、PoRVA和PDCoV的最低检测限均达1 copies·μL^(-1);重复性良好,组内和组间变异系数均小于1%;样本适应性广,检测不同样本类型时,变异系数均小于1%。与商品化试剂盒对比,本研究建立的方法PEDV和PoRVA的检测符合率为92.5%和97.5%,并对PDCoV的检测范围更广,对其变异毒株仍有较好的检测效果。本研究建立的检测方法具有特异性好、敏感性高、稳定性强和样本适应性广等优势,为临床腹泻样本提供了一种好的检测方法。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 猪A群轮状病毒 猪丁型冠状病毒 三重RT-qPCR
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PEDV、TGEV与PDCoV S蛋白表位基因三联疫苗的构建及其鉴定
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作者 刘青 顾天越 +9 位作者 包利霞 朱凡杰 王鑫源 刘婷婷 朱晓琛 鄢明华 董志民 王利丽 张东超 金天明 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第8期3495-3505,共11页
[目的]构建一种同时预防猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)的三联表位疫苗,以预防上述病原导致的猪的相关疾病。[方法]本研究运用免疫信息学在线软件对3种猪肠道冠状病毒(SeCoVs)的S蛋白B、T... [目的]构建一种同时预防猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)的三联表位疫苗,以预防上述病原导致的猪的相关疾病。[方法]本研究运用免疫信息学在线软件对3种猪肠道冠状病毒(SeCoVs)的S蛋白B、T细胞表位进行预测分析,构建新的表位肽段,命名为PPT,通过ExPASy、VaxiJen、TMHMM、SOPMA、SOLpro和AlphaFlod2等在线软件对PPT进行生物信息学分析,并利用C-IMMSIM在线软件对其免疫反应进行模拟。通过T2A将PPT与PEDV的COE序列、TGEV的SAD序列及PDCoV的CTD序列连接并构建至真核表达载体pEGFP-N1,经PCR和双酶切鉴定正确后,将获得的重组质粒转染HEK293A细胞,经DAPI染色、CCK8、RT-PCR及Western blotting试验验证重组质粒在体外表达情况。[结果]构建的表位蛋白PPT由17条表位肽段组成,经生物信息学软件分析,该蛋白为非跨膜蛋白,结构稳定,具有抗原性和可溶性,亲水性高,无过敏性。C-IMMSIM结果显示,PPT能引起机体树突状细胞(DC)增加,B、T细胞免疫反应,刺激免疫球蛋白IgG、IgM和细胞因子γ-干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)水平升高。重组质粒经PCR和双酶切鉴定结果显示,分别在3359、2375、1064、944、764和467 bp出现特异性目的条带,与预期相符;重组质粒转染HEK293A细胞后,可见绿色荧光;RT-PCR扩增分别在3359、2375、1064、944、764和467 bp处获得与目的基因大小相符的条带;CCK-8检测结果表明,重组质粒对细胞均无明显毒性作用;Western blotting检测结果显示,分别在31.7、16.1、37.9和27.5 ku处出现与目的蛋白分子质量大小一致的条带,重组质粒成功在HEK293A细胞中表达。[结论]本研究基于计算机软件分析设计的PPT表位蛋白成功构建三联疫苗,且在体外表达,为评价PEDV-TGEV-PDCoV三联表位疫苗的免疫效果提供依据。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒(PEDV) 猪传染性胃肠炎病毒(TGEV) 猪德尔塔冠状病毒(pdcov) S蛋白 表位疫苗
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猪肉及制品中HEV、PEDV和PDCoV三重qPCR方法的建立与应用
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作者 余姓鸿 张婧 +7 位作者 安微 杨苗 谢礼 舒佳新 薛昌华 郑巧 林华 韩国全 《食品工业科技》 CAS 北大核心 2024年第2期210-219,共10页
人兽共患病引发的动物源性食品安全事件频发,为从食品原料源头上控制和保障其食用安全,控制猪肉及其制品消费成本,本研究构建了可同时检测猪肉及制品中戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)、猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhe... 人兽共患病引发的动物源性食品安全事件频发,为从食品原料源头上控制和保障其食用安全,控制猪肉及其制品消费成本,本研究构建了可同时检测猪肉及制品中戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)、猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)和猪δ冠状病毒(Porcine delta corona virus,PDCoV)三重实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative PCR,qPCR)方法。结果表明,三重qPCR方法只能扩增出3种目的病毒的特异性基因片段,特异性好;对HEV、PEDV和PDCoV三种病毒的最低检测限分别为6.02、6.98、6.92 copies/μL;组内和组间变异系数(CV%)在0.10%~3.00%之间,重复性好。将所建立方法应用于248份出口猪肉及制品和282份生猪粪拭子的检测,同时以相应病毒标准检测方法进行平行检测,结果显示猪肉及制品中三种病毒的检出率均为0%,与标准方法检测结果一致。生猪粪拭子中,该方法对PEDV、PDCoV和HEV三种病毒的检出率分别为1.06%、3.19%、0.35%,标准方法检出率分别为1.06%、3.19%、0%。研究表明,建立的三重qPCR检测方法能准确快速地检测猪肉及制品或生猪样品中三种病毒,为保障生鲜猪肉及其制品市场流通和阻断病毒食源性传播提供技术支持。 展开更多
关键词 猪肉 戊型肝炎病毒(HEV) 猪流行性腹泻病毒(PEDV) 猪δ冠状病毒(pdcov) 三重qPCR
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基于高通量测序技术研究菊苣酸对PDCoV感染仔猪肠道菌群影响的研究
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作者 谢永生 王小月 +1 位作者 胡威 饶茜 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期365-373,共9页
为评价菊苣酸改善猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)感染仔猪后引起其的肠道菌群失衡,本研究设置菊苣酸组、菊苣酸+感染组、感染组和空白组的仔猪结肠内容物样品进行16S rRNA基因高通量测序(Illumina Mi Seq),利用生物信息学软件对各组仔猪肠道... 为评价菊苣酸改善猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)感染仔猪后引起其的肠道菌群失衡,本研究设置菊苣酸组、菊苣酸+感染组、感染组和空白组的仔猪结肠内容物样品进行16S rRNA基因高通量测序(Illumina Mi Seq),利用生物信息学软件对各组仔猪肠道微生物菌群多样性、菌群组成及物种差异进行分析。Alpha多样性分析显示,感染组仔猪结肠菌群多样性和丰度最低,菌群失衡;与感染组相比,菊苣酸+感染组仔猪结肠菌群多样性和丰度呈上升趋势。Beta多样性分析显示,菊苣酸+感染组的菌群结构与菊苣酸组、空白组相似,但与感染组存在差异。门、科、属、OUT水平的Venn分析显示,4个实验组中,菊苣酸组仔猪结肠菌群数量最多,感染组仔猪结肠菌群数量最少;菊苣酸+感染组仔猪结肠菌群数量与空白组相近。菌群群落组成分析显示,与空白组、菊苣酸组、菊苣酸+感染组相比,感染组仔猪的厚壁菌门(Firmicutes)、杆菌科(Lactobacillaceae)和乳杆菌属(Lactobacillus)的丰度呈升高趋势,拟杆菌门(Bacteroidota)的丰度降低趋势。菌群物种差异分析显示,互养菌门(Synergistota)的细菌丰度在空白组和菊苣组中呈显著增加,瘤胃球菌种(Ruminococcaceae)的细菌在感染组中的丰度最低。以上结果表明,仔猪口服菊苣酸后再以PDCoV感染,可改善PDCoV感染引起仔猪肠道菌群的失衡,恢复其肠道菌群的多样性和丰度。本研究为菊苣酸改善PDCoV感染引起仔猪肠道菌群的失衡提供了参考依据。 展开更多
关键词 猪德尔塔冠状病毒 16S rRNA基因 高通量测序 肠道菌群
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猪Deltacoronavirus RT-PCR检测方法的建立及其应用 被引量:23
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作者 逄凤娇 俞正玉 +5 位作者 何孔旺 徐向伟 郭容利 温立斌 姜平 李彬 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第9期683-686,共4页
猪Deltacoronavirus(PDCoV)是2014年在美国检测出的一种新型猪冠状病毒,能够引起感染猪出现水样腹泻、呕吐和脱水等症状。为及时评估该病毒在我国猪群中的感染和流行情况,本研究根据GenBank中登录的PDCoV核苷酸序列设计并合成一对... 猪Deltacoronavirus(PDCoV)是2014年在美国检测出的一种新型猪冠状病毒,能够引起感染猪出现水样腹泻、呕吐和脱水等症状。为及时评估该病毒在我国猪群中的感染和流行情况,本研究根据GenBank中登录的PDCoV核苷酸序列设计并合成一对特异性引物,在我国首次建立了PDCoV的RT.PCR检测方法。研究结果表明,所建立的RT.PCR检测方法仅对PDCoV核酸具有特异性扩增,对其它猪主要病毒核酸的扩增均呈阴性,具有较强的特异性;对PDCoV最低检测限为4.05×103拷贝/μL,敏感性较高;采用该方法对2014年~2015年我国华东地区猪场的526份临床样品进行检测,结果显示PDCoV总阳性率为4.75%(25/526),其中腹泻样品中阳性率为25.76%(17/66),表明我国猪群中存在PDCoV感染。本研究建立的RT—PCR方法可以作为临床检测PDCoV的一种有效手段。 展开更多
关键词 deltacoronavirus RT-PCR 检测
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稳定表达猪德尔塔冠状病毒N蛋白的Vero细胞系的建立及鉴定 被引量:1
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作者 钱炳旭 薄宗义 +7 位作者 白雪雁 张成成 郭梦娇 李梦娇 廖凯 薛峰 吴艳涛 张小荣 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第1期56-61,共6页
为获得稳定表达猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)核衣壳(N)蛋白的非洲绿猴肾(Vero)细胞系,本研究将PDCoV-N基因克隆入慢病毒载体中,获得重组质粒pLVX-PDCoV-N,利用慢病毒包装系统转染293T细胞,包装成表达N蛋白的慢病毒颗粒,慢病毒感染Vero细胞,... 为获得稳定表达猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)核衣壳(N)蛋白的非洲绿猴肾(Vero)细胞系,本研究将PDCoV-N基因克隆入慢病毒载体中,获得重组质粒pLVX-PDCoV-N,利用慢病毒包装系统转染293T细胞,包装成表达N蛋白的慢病毒颗粒,慢病毒感染Vero细胞,嘌呤霉素加压筛选目的细胞。RT-PCR扩增N基因和测序表明细胞系基因组中存在N蛋白编码序列,Western blot和IFA试验表明N蛋白可在细胞系中稳定表达。应用制备的细胞系对临床PDCoV阳性血清样品进行检测,与ELISA检测结果符合率达到100%。本研究成功建立了稳定表达PDCoV N蛋白的Vero细胞系,为PDCoV N蛋白生物学特性研究和PDCoV的临床检测、流行病学调查奠定了基础。 展开更多
关键词 猪德尔塔冠状病毒 核衣壳(N)蛋白 慢病毒 稳转细胞系
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基于转录组测序技术分析猪德尔塔冠状病毒感染ST细胞机制的初步研究 被引量:1
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作者 谢永生 张昆丽 +1 位作者 张建峰 贺东生 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期236-244,共9页
猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)感染可导致仔猪出现水样腹泻和死亡,严重危害猪的健康。为研究PDCo V感染引起宿主细胞基因转录水平的变化及初步研究其感染机制,本研究提取PDCo V感染组和不感染该病毒的阴性对照组ST细胞样品总RNA,构建二者的c... 猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)感染可导致仔猪出现水样腹泻和死亡,严重危害猪的健康。为研究PDCo V感染引起宿主细胞基因转录水平的变化及初步研究其感染机制,本研究提取PDCo V感染组和不感染该病毒的阴性对照组ST细胞样品总RNA,构建二者的cDNA文库后采用Illumina HiSeq 6000高通量测序平台进行转录组测序(RNA-Seq)。结果显示,所有样品的测序错误率均≤0.03%;Q20/%和Q30/%分别达98%和94%以上;GC含量在51.09%~55.15%;相关性分析结果显示,阴性对照组及感染组细胞样品各组内的R值均>0.9,上述结果表明测序数据可靠,可用于后续转录组学数据分析。采用ggplot2软件分析两组细胞组内测序结果的相关性,并以相关系数R>0.9判定各组内测序数据的准确性;采用DESeq2软件并以P<0.05和log2(Fold change)>1为条件筛选两组细胞中转录显著差异基因;采用ClusterProfiler R软件对转录显著差异基因进行GO功能和KEGG信号通路的富集分析;采用Pheatmap软件对各组ST细胞中与免疫反应相关的转录显著差异基因进行聚类分析;随机选择9个转录显著差异基因经RT-q PCR验证RNA-Seq的结果。筛选结果显示,与阴性对照组细胞相比,共筛选出5719个转录显著差异基因,其中3573个转录显著上调基因,2146个转录显著下调基因。GO功能和KEGG信号通路富集分析结果显示,转录显著上调的基因与ST细胞的免疫应答、防御反应等功能有关;转录显著下调的基因与细胞的氧化还原和新陈代谢等功能有关;转录显著上调的基因参与细胞因子受体互作、天然免疫反应相关、肿瘤坏死因子等的信号通路;转录显著下调的基因与细胞物质代谢信号通路有关,包括氨基酸代谢、脂代谢、乙醛酸和二羧酸代谢等信号通路。与免疫反应相关的转录显著差异基因的聚类分析结果显示,与阴性对照组细胞相比,PDCo V感染的ST细胞中白细胞介素基因(IL-1R1、1L-6、IL-10RB、IL-15和IL-12A等)、抗病毒基因(MX1、OAS)和干扰素基因(INFAR1、IFN-ALPHAOMEGA)的转录水平均显著上调。上述结果表明PDCo V感染后,ST细胞的天然免疫反应被激活,但细胞的代谢反应降低,这更有利于减弱病毒在ST细胞中的复制,起到一定的抗病毒效果。9个转录显著差异基因的RT-q PCR结果与RNA-seq结果基本一致,表明转录组测序数据可靠。本研究为进一步解析PDCo V的感染机制提供参考依据。 展开更多
关键词 猪德尔塔冠状病毒 转录组测序 转录显著差异基因
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猪德尔塔冠状病毒致病机理研究进展
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作者 石迎 陶洁 +2 位作者 李本强 程靖华 刘惠莉 《上海农业学报》 2024年第4期127-134,共8页
猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)是流行于猪群中的一种新发肠道冠状病毒,能引起猪腹泻、呕吐、脱水甚至死亡,给养猪业带来巨大威胁。PDCoV可在猪、禽类和牛体内复制,甚至在人体血浆样品中检出,具有潜在的公共安全问题... 猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)是流行于猪群中的一种新发肠道冠状病毒,能引起猪腹泻、呕吐、脱水甚至死亡,给养猪业带来巨大威胁。PDCoV可在猪、禽类和牛体内复制,甚至在人体血浆样品中检出,具有潜在的公共安全问题,存在引发大流行的威胁,深入开展PDCoV的致病机理研究对该病的防控有重要意义。本文从其入侵宿主细胞以拮抗干扰素反应、诱导细胞凋亡、调控细胞自噬、抑制细胞焦亡途径来逃避宿主免疫应答,以及其他影响PDCoV复制的分子机制方面对其致病机理进行总结,为后续科学研究和有效防治提供借鉴。 展开更多
关键词 德尔塔冠状病毒 致病机理 研究进展
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PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV多重TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用 被引量:19
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作者 施开创 王睿敏 +4 位作者 黎宗强 谢守玉 尹彦文 陆文俊 屈素洁 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期595-600,共6页
为建立鉴别检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)和猪轮状病毒(PRoV)的方法,本研究分别针对PEDVN基因、TGEVM基因、PDCoVM基因和PRoVVP6基因设计特异性引物和TaqMan探针,经过优化反应条件,... 为建立鉴别检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)和猪轮状病毒(PRoV)的方法,本研究分别针对PEDVN基因、TGEVM基因、PDCoVM基因和PRoVVP6基因设计特异性引物和TaqMan探针,经过优化反应条件,建立了同时检测4种病毒的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法仅特异性扩增PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV,与猪其它主要病毒无交叉反应,特异性较强;对PEDV、TGEV、PDCoV和PRoV的质粒标准品的最低检出限分别为2.06×10^2拷贝/μL、2.06×10^2拷贝/μL、2.06×10^1拷贝/μL、2.06×10^3拷贝/μL,具有较高敏感性;组内与组间变异系数均小于1.1%,具有良好的重复性。应用该方法和普通多重RT-PCR检测临床采集的243份腹泻病料样品,两者的符合率为96.71%。本研究建立的方法为临床PEDV、TGEV、PDCoV、PRoV的鉴别检测及流行病学调查提供了一种快速、特异、敏感、高效的技术手段。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 猪传染性胃肠炎病毒 猪德尔塔冠状病毒 猪轮状病毒 荧光定量RT-PCR
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A Highly Pathogenic Strain of Porcine Deltacoronavirus Caused Watery Diarrhea in Newborn Piglets 被引量:23
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作者 Zhichao Xu Huiling Zhong +5 位作者 Qingfeng Zhou Yunping Du Li Chen Yun Zhang Chunyi Xue Yongchang Cao 《Virologica Sinica》 SCIE CAS CSCD 2018年第2期131-141,共11页
Porcine deltacoronavirus(PDCoV) is a newly identified virus that causes watery diarrhea in newborn piglets and results in significant economic losses to the pig industry. Since first reported in Hong Kong in 2012, PDC... Porcine deltacoronavirus(PDCoV) is a newly identified virus that causes watery diarrhea in newborn piglets and results in significant economic losses to the pig industry. Since first reported in Hong Kong in 2012, PDCoV has been subsequently detected in USA, South Korea, Thailand, and China's Mainland. Here we isolated a strain of PDCoV, named CHN-GD-2016,from the intestinal content of a diseased newborn piglet with severe diarrhea in a pig farm in Guangdong, China. PDCoV CHN-GD-2016 could be identified by immunofluorescence with PDCoV specific rabbit antisera, and typical crown-shaped particles with spiky surface projections of this PDCoV were observed with electron microscopy. Genomic analysis showed that the PDCoV CHN-GD-2016 was closely related to other Chinese PDCoV strains, with the highest sequence similarity with the strain CHN/Tianjin/2016. Importantly, inoculation of newborn piglets with 1×10~5 TCID_(50) of CHN-GD-2016 by oral feeding successfully reproduced clear clinical symptoms, including vomiting, dehydration, and severe diarrhea in piglets. In addition, the virus RNA in rectal swabs from 1 to 7 days post inoculation was detected, macroscopic and microscopic lesions in small intestine were observed, and viral antigen was also detected in the small intestines with immunohistochemical staining. Collectively, the data show in this study confirms that PDCoV is present in Guangdong,China and is highly pathogenic in newborn piglets. 展开更多
关键词 porcine deltacoronavirus (pdcov Genomic analysis PATHOGENICITY Southern China
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猪德尔塔冠状病毒N蛋白单克隆抗体2D7的制备与生物学特性鉴定
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作者 张宁 赵平 +12 位作者 刘思雨 赵硕 陈忠伟 何颖 欧阳康 卢冰霞 蒋家霞 郭旋 林昌华 赵武 黄伟坚 秦毅斌 赵凌 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2024年第5期115-125,共11页
为获得猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)N蛋白的特异性单克隆抗体(Monoclonal antibody,mAb),并鉴定其生物学特性,本研究利用RT-PCR方法扩增PDCoV-N基因,构建表达质粒,转化BL21感受态细胞获得重组大肠杆菌,诱导表达后... 为获得猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)N蛋白的特异性单克隆抗体(Monoclonal antibody,mAb),并鉴定其生物学特性,本研究利用RT-PCR方法扩增PDCoV-N基因,构建表达质粒,转化BL21感受态细胞获得重组大肠杆菌,诱导表达后获得PDCoV-N重组蛋白,将其进行纯化后再免疫小鼠,制备针对PDCoV-N蛋白的mAb,并进行了抗体的效价测定、免疫荧光(IFA)、Western blot、亚类的鉴定、mAb特异性的鉴定。结果,成功构建pColdⅡ-PDCoV-N重组原核表达质粒,SDS-PAGE显示重组N蛋白成功表达,分子质量约为38 kDa;经小鼠免疫、细胞融合、亚克隆筛选获得1株分泌PDCoV-N蛋白抗体的阳性杂交瘤细胞株;制备的腹水经间接ELISA方法测定抗体的效价为2.048×10^(6)。IFA、Western blot试验表明该mAb可以与PDCoV-N蛋白及全病毒特异性结合,亚类鉴定其亚型为IgG1,轻链为κ链。该mAb只与PDCoV反应,而与其他猪肠道病毒无交叉反应,表明本研究制备的mAb具有良好的特异性。本研究成功制备了PDCoV-N蛋白的mAb,为进一步研究PDCoV的生物学特性和诊断试剂的开发提供技术支持。 展开更多
关键词 猪德尔塔冠状病毒 N蛋白 单克隆抗体
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2022年江苏省4种猪腹泻病毒分子流行病学调查
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作者 樊毛迪 李群 +7 位作者 侯闻闻 朱振邦 丁国伟 范娟 李智 曲向阳 陈昌海 李向东 《畜牧与兽医》 CAS 北大核心 2024年第8期44-58,共15页
为了解江苏省猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪δ冠状病毒(PDCoV)、猪轮状病毒(PoRV)流行毒株的遗传变异趋势,采集了2022年江苏省不同猪场的病猪腹泻病料36份,使用RT-PCR方法分别检测PEDV、TGEV、PDCoV和PoRV感染... 为了解江苏省猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪δ冠状病毒(PDCoV)、猪轮状病毒(PoRV)流行毒株的遗传变异趋势,采集了2022年江苏省不同猪场的病猪腹泻病料36份,使用RT-PCR方法分别检测PEDV、TGEV、PDCoV和PoRV感染情况,并对部分检测结果为阳性的PEDV、TGEV、PDCoV进行S基因扩增、测序和分析,对PoRV进行VP4、VP7基因扩增、测序和分析,共获得8个PESV S基因,1个TGEV S基因,1个PDCoV S基因,9个PoRV VP4及VP7基因序列。基于PEDV S基因的序列分析结果表明,2022年江苏PEDV流行毒株与我国2010年以来流行的GⅡ-b亚群变异株的序列同源性为97.0%~99.7%,属于同一亚群,而与CV777、SD-M等早期毒株亲缘关系较远;江苏PEDV流行毒株S1蛋白区域存在氨基酸的突变、插入及缺失,不同流行毒株之间存在一定的差异。基于TGEV S基因的序列分析结果表明,江苏TGEV流行毒株与中国毒株WH-1同源性最高,为99.9%;其S基因仅发生了3个氨基酸突变。基于PDCoV S基因的序列分析结果表明,江苏PDCoV流行毒株与CHN/HG/2017株的同源性最高,为98.2%,与来自中国、越南、老挝、泰国等东南亚国家的毒株亲缘关系较近,属于同一群;江苏PDCoV流行毒株的S1蛋白区域发生6个氨基酸的突变。基于PoRV VP4及VP7基因的序列分析结果表明,江苏PoRV流行毒株属于A群轮状病毒,具有G3[P13]型、G3[P23]型、G4[P13]型、G4[P23]型、G9[P13]型、G9[P23]和G11[P13]型7个不同的基因组合型。本研究结果为掌握江苏地区PEDV、TGEV、PDCoV、PoRV的流行情况、遗传进化趋势及其防控提供了理论依据。 展开更多
关键词 猪流行性腹泻病毒 猪传染性胃肠炎病毒 猪δ冠状病毒 猪轮状病毒 S基因 VP4基因 VP7基因
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猪δ冠状病毒重庆流行株的诊断与N基因序列分析
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作者 吴学婧 于吉锋 +4 位作者 叶勇刚 肖璐 毛从剑 曹冶 康润敏 《畜禽业》 2024年第2期1-8,共8页
2023年重庆市某规模化养猪场猪群发生腹泻疫情,通过临床观察、RT-PCR检测、N基因克隆测序及序列分析对采集的腹泻仔猪肠道组织进行鉴定。结果显示,发病猪水样腹泻,小肠壁变薄、黏膜充血;成功检测到1株猪δ冠状病毒(porcine deltacoronav... 2023年重庆市某规模化养猪场猪群发生腹泻疫情,通过临床观察、RT-PCR检测、N基因克隆测序及序列分析对采集的腹泻仔猪肠道组织进行鉴定。结果显示,发病猪水样腹泻,小肠壁变薄、黏膜充血;成功检测到1株猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV),命名为CQ2023株。该毒株N基因序列全长1029 bp,与30株GenBank中登录的参考毒株N基因序列比对显示,核苷酸序列相似性为96.7%~99.4%,其中PDCoV CQ2023株与CHN-HeN06-2022株的相似性最高,为99.4%。遗传进化分析显示PDCoV CQ2023株属于国内流行株,与国内PDCoV毒株CHN-HeN06-2022等处于同一进化分支,亲缘关系最近。该次研究成功鉴定出该猪场腹泻疫情由PDCoV感染引起,并进行了N基因序列分析,为PDCoV的流行病学研究、遗传进化、预防及诊断试剂的研究提供数据支持。 展开更多
关键词 猪δ冠状病毒 诊断 N基因 遗传进化分析
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基于重组核衣壳蛋白的猪德尔塔冠状病毒间接ELISA检测方法的建立
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作者 胡帅琪 丛潇 +5 位作者 练月晓 伍妙梨 朱于军 丛锋 顾有方 闻爱友 《安徽科技学院学报》 2024年第3期25-33,共9页
目的:建立一种关于猪德尔塔冠状病毒(Porcine Deltacoronavirus, PDCoV)抗体的检测方法。方法:对猪德尔塔冠状病毒的核衣壳蛋白(N)进行原核表达,通过Western Blot、SDS-PAGE等方法,对重组蛋白进行鉴定;在获得正确表达的重组蛋白后,以此... 目的:建立一种关于猪德尔塔冠状病毒(Porcine Deltacoronavirus, PDCoV)抗体的检测方法。方法:对猪德尔塔冠状病毒的核衣壳蛋白(N)进行原核表达,通过Western Blot、SDS-PAGE等方法,对重组蛋白进行鉴定;在获得正确表达的重组蛋白后,以此为抗原,对ELISA反应条件进行优化,并对其特异性、敏感性、重复性进行测试,最终建立ELISA检测方法,并对临床样品进行检测。结果:优化后的抗原包被浓度为2μg/孔,37℃孵育1 h;1%BSA 37℃封闭1 h;一抗稀释最佳浓度为1∶1 600,孵育时间为1 h;酶标二抗最佳孵育时间为60 min。重组蛋白能与猪德尔塔冠状病毒血清发生特异性反应,所建立的检测方法具有优良的敏感性、特异性、重复性。结论:本研究建立了一种针对猪德尔塔冠状病毒的间接ELISA检测方法,为猪德尔塔冠状病毒的抗体水平检测及疾病的防控提供了一种有效的方法。 展开更多
关键词 猪德尔塔冠状病毒 重组核衣壳蛋白 间接ELISA 诊断方法
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猪德尔塔冠状病毒N蛋白原核表达及其多克隆抗体制备
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作者 赵梓桥 张昆丽 +4 位作者 张春红 翟少伦 康欣桐 黄淑坚 张建峰 《南方农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第6期1798-1806,共9页
【目的】构建猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)核衣壳(N)蛋白原核表达系统并制备多克隆抗体,为新型疫苗、诊断试剂研发及PDCoV致病机制的深入研究提供基础。【方法】提取PDCoV HeN17株RNA,经RT-PCR扩增,将N基因克隆至p... 【目的】构建猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)核衣壳(N)蛋白原核表达系统并制备多克隆抗体,为新型疫苗、诊断试剂研发及PDCoV致病机制的深入研究提供基础。【方法】提取PDCoV HeN17株RNA,经RT-PCR扩增,将N基因克隆至pGEX-6P-1载体构建重组原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并进行IPTG诱导表达。利用Glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化重组蛋白,采用3C蛋白酶去除标签。以纯化后的N蛋白为免疫原免疫3月龄新西兰大白兔制备多克隆抗体,采用间接酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定抗体效价,并通过Western blotting、间接免疫荧光试验(IFA)和免疫沉淀(IP)试验对其进行鉴定。【结果】成功构建原核表达载体pGEX-6p-1-PDCoV-N,获得的PDCoV-N-GST重组蛋白主要以可溶性形式表达,大小约69 kD,经去除GST标签可获得单一目的蛋白条带,经测定蛋白浓度为12.6 mg/mL,获得的PDCoV-N蛋白能与PDCoV阳性血清反应产生单一特异性条带。制备的兔源抗PDCoV-N多克隆抗体效价达1∶4096000,可特异性识别pCAGGS-Flag-N转染HEK-293T细胞中表达的Flag-N蛋白和PDCoV感染LLC-PK1细胞中表达的PDCoV-N蛋白,且能检测到PDCoV-N真核表达载体pCAGGS-Flag-N转染HEK-293T细胞中表达的PDCoV-N蛋白。【结论】成功构建高效PDCoV-N原核表达系统,获得纯度好、浓度高且免疫原性佳的PDCoV-N蛋白,制备的兔源抗PDCoV-N多克隆抗体效价高,具有较强亲和力和特异性,可用于Western blotting、IFA和IP检测。 展开更多
关键词 猪德尔塔冠状病毒(pdcov) N蛋白 原核表达 多克隆抗体
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猪δ冠状病毒(PDCoV)N蛋白的原核表达及多克隆抗体制备 被引量:3
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作者 陈汭 付嘉钰 +10 位作者 刘浩宇 李成 赵玉佳 胡靖飞 瞿欢 曹三杰 文心田 文翼平 赵勤 伍锐 黄小波 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2020年第8期104-110,共7页
旨在表达和纯化猪δ冠状病毒(PDCoV)N蛋白并制备该蛋白的多克隆抗体。以RT-PCR扩增PDCoV N基因并与表达载体pET-28a构建重组质粒,转化Transetta(DE3)菌株诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白表达,以纯化的N蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,Wester... 旨在表达和纯化猪δ冠状病毒(PDCoV)N蛋白并制备该蛋白的多克隆抗体。以RT-PCR扩增PDCoV N基因并与表达载体pET-28a构建重组质粒,转化Transetta(DE3)菌株诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白表达,以纯化的N蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,Western blot验证兔抗血清特异性,间接ELISA测定抗血清效价。利用间接免疫荧光试验(IFA)、免疫荧光试验(IF)、流式细胞术(FCM)鉴定其诊断应用价值。重组N蛋白为可溶性表达,大小约为44 kD,制备的兔抗N蛋白抗体效价可达1∶204800。IFA与FCM试验证实该抗体能与PDCoV特异性结合,与PEDV及TGEV无交叉反应,IF试验表明该抗体可用于检测小肠组织中的PDCoV。 展开更多
关键词 猪δ冠状病毒 N蛋白 原核表达 多克隆抗体
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PDCoV与TGEV双重实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用 被引量:6
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作者 王征帆 朱利塞 +6 位作者 王娟 李祎云 向蕊 应碧云 王贵平 贾爱卿 白挨泉 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2021年第10期3855-3863,共9页
试验旨在建立快捷、高效而准确的鉴别诊断猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)与传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)的双重实时荧光定量PCR方法。通过绘制双重实时荧光定量PCR的标准曲线,检验... 试验旨在建立快捷、高效而准确的鉴别诊断猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)与传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)的双重实时荧光定量PCR方法。通过绘制双重实时荧光定量PCR的标准曲线,检验该方法的特异性、敏感性和重复性,并对临床样品进行检测。结果显示,双重实时荧光定量PCR方法的循环阈值与PDCoV和TGEV质粒拷贝数的对数之间存在良好的线性关系,且对应的相关系数分别为R2(P)=0.9994和R2(T)=0.996;能特异性地检测PDCoV和TGEV,而与PEDV、PRV、PRRSV、CSFV和RV无交叉反应,具有较强的特异性;检验PDCoV与TGEV质粒标准品的最低检测限度分别达到2和20拷贝/μL,且分别比常规RT-PCR高1000和100倍,具有较高的敏感度;PDCoV与TGEV的批内和批间重复性检测的Ct均值基本相同,且变异系数(CV)均<2%,具有较好的重复性。用该方法对114份仔猪腹泻样品检测结果显示,PDCoV和TGEV的阳性率分别为5.6%(6/114)和8.8%(10/114),混合感染检出率为4.6%(5/114),比常规RT-PCR具有更高的检出率和敏感性。结果表明,本试验建立的双重实时荧光定量PCR方法具有特异性强、灵敏度高、重复性和稳定性好等优点,适用于病毒早期诊断和批量临床样品检测,为疾病防控、流行病学调查及相关性研究提供了技术支持及数据参考。 展开更多
关键词 猪德尔塔冠状病毒(pdcov) 传染性胃肠炎病毒(TGEV) TAQMAN探针 双重实时荧光定量PCR
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猪丁型冠状病毒N基因原核表达及多克隆抗体制备 被引量:3
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作者 刘磊 何颖 +14 位作者 陈忠伟 赵武 段群棚 赵硕 梁家幸 周英宁 全琛宇 许心婷 陈婷婷 许艺兰 李斌 蒋冬福 卢敬专 秦毅斌 卢冰霞 《畜牧与兽医》 CAS 北大核心 2023年第2期67-72,共6页
旨在研究猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)N蛋白的抗原性,为下一步诊断试剂盒的研发提供依据。试验通过RT-PCR的方法扩增PDCoV CH/GX/1468B/2017株完整的N基因并构建原核表达质粒pET32a-N,将pET32a-N转化至大肠杆菌BL21... 旨在研究猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)N蛋白的抗原性,为下一步诊断试剂盒的研发提供依据。试验通过RT-PCR的方法扩增PDCoV CH/GX/1468B/2017株完整的N基因并构建原核表达质粒pET32a-N,将pET32a-N转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中,经诱导表达获得重组N蛋白,纯化后经Western blot方法检测其反应原性,免疫昆明小鼠制备重组N蛋白多克隆抗体并进行效价测定(间接ELISA法)和特异性验证(间接免疫荧光法)。结果显示:重组N蛋白在IPTG终浓度为1.0 mmol/L,37℃诱导表达6 h的条件下可获得最高表达量,该重组蛋白主要以可溶性蛋白的形式表达;Western blot结果显示,纯化后的重组N蛋白可以和PDCoV阳性猪血清发生特异性结合,具有良好的反应原性。制备的多克隆抗体的效价可达1∶64000,间接免疫荧光法结果表明其能特异性识别和结合PDCoV,说明重组N蛋白具有较好免疫原性。提示:PDCoV N蛋白抗原性好,可作为诊断试剂盒的候选抗原。 展开更多
关键词 猪丁型冠状病毒 N基因 原核表达 多克隆抗体 抗原性分析
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猪德尔塔冠状病毒RT-nPCR检测方法的建立与N基因变异分析
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作者 朱小甫 吴旭锦 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2023年第6期72-77,共6页
建立一种基于猪德尔塔冠状病毒(PDCo V)N基因的RT-n PCR检测方法,对陕西省猪群PDCo V感染情况进行流行病学调查,分析PDCo V流行毒株N基因变异情况。通过病毒分离、检测引物设计、反应体系与条件优化、灵敏性试验和特异性试验,建立了PDCo... 建立一种基于猪德尔塔冠状病毒(PDCo V)N基因的RT-n PCR检测方法,对陕西省猪群PDCo V感染情况进行流行病学调查,分析PDCo V流行毒株N基因变异情况。通过病毒分离、检测引物设计、反应体系与条件优化、灵敏性试验和特异性试验,建立了PDCo V RT-nPCR检测方法,并对N基因片段进行序列分析。结果表明:建立的RT-n PCR方法能够扩增出303 bp的N基因目的片段,检测单链c DNA的极限为2.0194×10^(-3)ng·μL^(-1),该方法检测PEDV、TGEV、PRo V、CSFV与PRRSV均无交叉反应,特异性良好;陕西省猪场184份样品检测结果显示,PDCo V阳性率为6.52%(12/184);N基因序列分析发现,获得的HY2019、QLS2020的N基因片段同源性为99.0%,提示可能为同一来源;进化树分析发现,HY2019、QLS2020与我国四川株SCNC201705、Sichuan2017、Sichuan2019同处于一个小的进化分支上,且均存在168~179位“TGTCTGTCTCTA”共12个核苷酸缺失,推测陕西株与四川株高度同源,可能起源于早期四川毒株。 展开更多
关键词 猪德尔塔冠状病毒 仔猪腹泻 检测 反转录-聚合酶链式反应
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猪δ冠状病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立
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作者 孙彦婷 康宇 +5 位作者 路亚男 井汇源 董望 李向辉 王金合 唐光武 《现代牧业》 2023年第3期12-17,共6页
建立一种快速检测猪δ冠状病毒(PDCoV)的方法。根据GeneBank收录的PDCoV M基因序列,设计两对特异性引物和TaqMan探针,对PDCoV TaqMan荧光定量RT-PCR反应条件进行优化。Ct值与质粒模板之间呈现良好的线性关系,标准方程为y=-3.6421x+34.1... 建立一种快速检测猪δ冠状病毒(PDCoV)的方法。根据GeneBank收录的PDCoV M基因序列,设计两对特异性引物和TaqMan探针,对PDCoV TaqMan荧光定量RT-PCR反应条件进行优化。Ct值与质粒模板之间呈现良好的线性关系,标准方程为y=-3.6421x+34.194,相关系数R 2=0.9992。荧光定量RT-PCR方法仅对PDCoV呈现特异性扩增,无交叉反应。敏感度试验结果显示,最低检出量为1.25×10^(1)copies/μL,灵敏度高。重复性试验结果显示,批内和批间测定均具有良好的重复性。TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法是一种可靠的快速检测PDCoV的方法。 展开更多
关键词 猪δ冠状病毒 M基因 荧光定量RT-PCR TAQMAN
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