利用CRISPR/Cas9编辑系统构建ACTA1基因敲除的PEFs细胞系

【目的】利用CRISPR/Cas9技术获得α-肌动蛋白1(actin alpha 1,ACTA1)基因敲除的猪胎儿成纤维细胞(porcine embryo fibroblasts, PEFs),为后续在细胞水平上探究猪ACTA1基因功能及发掘友好基因座位奠定基础。【方法】通过实时荧光定量PCR检测ACTA1基因在巴马小型猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背部皮下脂肪和背最长肌7种组织中的表达情况;利用CRISPOR在线网站在猪ACTA1基因第7外显子区域设计3条向导RNA(single guide RNA,sgRNA),并将其连接至pX330载体;通过T7E1酶切检测不同sgRNA活性,选择效率较高且符合目标的载体质粒共转染至PEFs中;利用有限稀释法筛选单克隆细胞,并对获得的单克隆细胞进行基因型鉴定和脱靶分析。【结果】实时荧光定量PCR结果表明,ACTA1基因在背最长肌中的表达量极显著高于其他组织(P<0.01)。设计的3条sgRNA的基因编辑效率分别为24.87%(sgRNA1)、39.59%(sgRNA2)、36.93%(sgRNA3),综合切割位置和基因编辑效率,选用sgRNA1和sgRNA2共转染细胞。基因型鉴定结果表明,获得的69株单克隆细胞中有20株单克隆细胞发生了编辑,其中单等位基因片段敲除细胞3株,双等位基因片段敲除细胞1株,片段敲除效率为5.8%(4/69)。脱靶分析结果显示,在预测的脱靶位点未检测到脱靶效应。【结论】本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑系统成功构建了ACTA1基因纯合敲除的PEFs,研究结果为进一步探究ACTA1基因对猪骨骼肌发育调控提供了技术支撑和理论基础,同时为挖掘猪组织特异性表达的友好位点提供新思路。

不同胰蛋白酶在制备腮腺炎减毒活疫苗中的效果比较

目的比较基因重组胰蛋白酶和猪源胰蛋白酶在腮腺炎减毒活疫苗中的使用效果。方法使用浓度为10%、15%、20%基因重组胰蛋白酶制备鸡胚成纤维细胞,通过细胞密度、细胞活性、24 h以及48 h细胞贴壁状态等指标确定基因重组胰蛋白酶使用浓度;与猪源胰蛋白酶进行比较,通过细胞密度、细胞活性、48 h细胞贴壁状态以及病毒滴度等指标比较两种胰蛋白酶的使用效果;使用基因重组胰蛋白酶制备3批腮腺炎减毒活疫苗,检定疫苗的稳定性;规模化放大验证该工艺的稳定性。结果通过研究发现基因重组胰蛋白酶的使用浓度为15%;与猪源胰蛋白酶进行比较,两种胰酶制备的细胞密度水平一致,无显著性差异(P>0.05),48 h后细胞均生长至单层,细胞状态良好,按照同一MOI进行接毒,病毒滴度无显著性差异(P>0.05);使用CF-10进行试验,病毒滴度也无差异(P>0.05);连续3批使用基因重组胰蛋白酶制备的疫苗热稳定性良好,且该工艺可以规模化放大。结论在制备腮腺炎减毒活疫苗中可以使用浓度15%的基因重组胰蛋白酶替代猪源胰蛋白酶,作为鸡胚成纤维细胞消化液使用。

借助慢病毒将EGFP基因导入西藏小型猪胎儿成纤维细胞

目的借助慢病毒将EGFP基因导入西藏小型猪胎儿成纤维细胞(porcine embryonic fibroblasts,PEFs),以基于PEFs建立慢病毒介导的外源基因体外投递系统。方法取35d西藏小型猪胚胎,酶消化法分离培养西藏小型猪的PEFs;按Invitrogen公司推荐的标准程序进行慢病毒(携带EGFP基因)包装(脂质体介导的瞬时转染),随后用病毒上清感染PEFs,24～48h后荧光显微镜下观察是否见绿色荧光以证实慢病毒是否成功生产和成功感染PEFs。结果成功分离培养西藏小型猪的PEFs,按标准程序生产的携带EGFP基因慢病毒高效率感染西藏小型猪的PEFs。结论针对西藏小型猪的PEFs建立了相应的慢病毒介导的外源基因体外投递系统,为相关后续研究打下了良好基础。

胎儿成纤维细胞的培养分离方法对猪体细胞核移植胚胎发育潜力的影响

研究采用不同传代的培养方法和不同方法处理及不同培养分离法探讨胎儿成纤维细胞的处理方法对猪体细胞胚胎发育潜力的影响。结果表明:(1)100%长满汇合胎儿成纤维细胞的核移植融合率高于70%～80%的胎儿成纤维细胞(P<0.05),分裂率高于血清饥饿培养的胎儿成纤维细胞(P<0.05),但囊胚率差异不显著(P>0.05);(2)猪胎儿成纤维细胞冷冻-解冻后的核移植分裂率和囊胚发育率均显著低于新鲜和4℃冷藏的细胞(P<0.05),但融合率无显著差异(P>0.05),表明猪胎儿成纤维细胞解冻后不宜直接进行核移植;(3)采用组织块法和酶消化法分离得到的胎儿成纤维细胞所构建的重构胚胎在融合率、分裂率和囊胚率方面没有显著差异(P>0.05)。表明100%长满汇合培养是较好的猪胎儿成纤维细胞培养处理方法;猪胎儿成纤维细胞解冻后不宜直接进行核移植;组织块法和酶消化法均可用于分离培养猪体细胞核移植的胎儿成纤维细胞。

BGJ398对猪孤雌胚胎早期发育的影响

为了研究FGF信号通路对猪胚胎早期胚层分化的影响,试验采用QRT-PCR方法检测FGF信号通路抑制剂BGJ398处理后猪孤雌囊胚多能性及胚层标志基因SOX2、OCT4、KLF4、CDX2、NANOG和GATA4的表达变化。结果表明:BGJ398促进了多能性和滋养层标志基因的表达,SOX2、OCT4、KLF4和CDX2的相对表达量分别是对照组的4.13,3.25,33.06,2.59倍,但未显著影响原始外胚层标志基因NANOG和内胚层标志基因GATA4的表达。说明BGJ398并未显著影响内外胚层的分化,因此推断FGF信号通路对于猪胚胎早期胚层分化可能并不是必需的。

重组猪胰蛋白酶在制备狂犬病疫苗(鸡胚成纤维细胞)中的应用

目的探索重组猪胰蛋白酶(简称重组猪胰酶)在制备狂犬病疫苗[鸡胚成纤维细胞(chicken embryo fibroblast,CEF)]中的应用。方法采用SDS-PAGE及Western blot法分析鉴定重组猪胰酶及猪胰酶;用1.25 mg/mL猪胰酶及1、0.25、0.0625、0.015625 mg/mL重组猪胰酶分别消化制备原代CEF,比较细胞活率、单胚细胞收获量、体外培养48 h的细胞增殖比及培养96 h的细胞形态,筛选最适重组猪胰酶工作浓度;用最适浓度重组猪胰酶及1.25 mg/mL猪胰酶消化后原代CEF对狂犬病病毒滴度的影响。结果重组猪胰酶仅有1条蛋白条带,纯度100%,而猪胰酶有多条蛋白杂带,纯度33%;与1.25 mg/mL猪胰酶比较,0.0625 mg/m L重组猪胰酶消化的CEF细胞活率、单胚细胞收获量及培养48 h的细胞增殖比差异均无统计学意义(P均>0.05),且其细胞形态相当,其最适工作浓度为0.0625 mg/mL;2种胰酶制备CEF的狂犬病病毒滴度差异无统计学意义(P>0.05)。结论重组猪胰酶可代替猪胰酶用于狂犬病疫苗(CEF细胞)的生产。