抑制猪支持细胞外泌体对精原干细胞自我更新及分化的影响

[目的]本文利用体外模型检测猪支持细胞分泌外泌体的能力及其对猪精原干细胞(porcine spermatogonial stem cells,pSSC)自我更新及分化状态的影响。[方法]通过两步酶消化法分离猪支持细胞和pSSC并建立猪支持细胞-pSSC体外共培养模型,抑制猪支持细胞外泌体的分泌,检测pSSC自我更新及分化指标,研究支持细胞外泌体对pSSC命运的影响。[结果]分离得到的支持细胞的Wilm肿瘤蛋白1(WT1)阳性率为(87.1±0.02)%,整合素β-1蛋白(ITGB1)阳性率为(94.2±0.01)%,分离得到pSSC的早幼粒细胞白血病锌指蛋白(PLZF)阳性率为(80.6±0.02)%;通过Western blot分析、免疫荧光检测证实支持细胞外泌体的存在;证实20μmol·L^(-1)GW4869可以抑制外泌体分泌且不损害支持细胞;GW4869处理后的支持细胞与pSSC共培养发现试验组较对照组pSSC状态差异较为明显,且RT-PCR结果显示猪精原干细胞PLZF基因表达水平显著升高;肥大/干细胞生长因子受体基因(KIT)、胸腺细胞抗原1基因(THY1)、死盒解旋酶4基因(DDX4)表达水平显著降低;Western blot结果显示猪精原干细胞蛋白基因产物9.5(PGP9.5)蛋白表达水平升高,DDX4蛋白表达水平降低。[结论]体外培养时支持细胞分泌的外泌体对pSSC自我更新和分化均具有调控作用,暗示外泌体是支持细胞调控精原干细胞命运的一种重要方式,这为种公猪生殖力的改善提供了新思路。

猪精原干细胞体外培养条件的优化

以出生后1～5 d的长白公猪为主要研究对象,采用两步酶消化法获取睾丸细胞悬液,用Percoll不连续密度梯度法对猪精原干细胞(PSSCs)进行纯化,以碱性磷酸酶(AP)染色鉴定;利用MTT法检测2种细胞因子——胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)和白血病抑制因子(LIF)对PSSCs发育的影响.结果表明:用Percoll不连续密度梯度法获得的PSSCs占睾丸总细胞数的(8.19±0.83)%,AP染色的阳性率为(87.47±2.90)%,表明该方法可有效获取PSSCs;MTT法检测表明,20 ng.mL-1 GDNF+1 000 U.mL-1 LIF的组合添加对PSSCs体外增殖的效果最好.

达兰猪精原干细胞的分离、纯化和初步鉴定

对达兰仔猪睾丸精原细胞及精原干细胞进行了体外分离、纯化和初步鉴定。对8d达兰仔猪的睾丸实质组织，采用Ⅳ型胶原酶、透明质酸酶和胰酶组合消化法分离精细管细胞，制备单细胞悬液，用Percoll不连续密度（11％、19％、27％、35％和43％）梯度法纯化精原细胞；对纯化后的细胞培养12h，细胞贴壁后进行碱性磷酸酶（AKP）染色鉴定，初步确定精原千细胞及其比例。结果表明：所获精细管细胞悬液中活细胞和死细胞所占的比率分别为92．65％和7．35％，平均每克睾丸可获得4．17×10^7个细胞；精原细胞主要分布于19％～27％的Percoll梯度带中，经纯化后其纯度为47．62％，精原千细胞占该带细胞的比例为5．52％。因此，采用组合酶消化，结合Percoll不连续密度梯度离心法分离的达兰仔猪的精原细胞不但能够满足体外培养的需要，还可以做为精原千细胞移植的研究材料。

猪精原干细胞超微结构观察与体外冻存条件的优化研究

【目的】检测猪精原干细胞(PSSCs)在分化过程中其内部超微结构及细胞器的变化情况,并且找到适宜PSSCs的冷冻保存条件,为长期保存PSSCs和研究PSSCs的分化机制提供科学依据.【方法】采用两步酶消化法和Percoll不连续密度梯度法获取PSSCs,利用透射电子显微镜(TEM)对PSSCs在体外不同培养时间的超微结构变化进行观测,并且利用台盼蓝染色法和碱性磷酸酶(AP)染色法比较不同浓度的甘油和二甲基亚砜(DMSO)保存液对PSSCs冻存效果的影响.【结果和结论】未分化的PSSCs细胞膜完整平滑,细胞器正常,胞质均匀,无伪足出现,细胞核清晰.而开始分化的PSSCs出现伪足,线粒体数量大幅增加.冻存7 d后,解冻结果表明,PSSCs以V(DMSO)∶V(DMEM/F12)∶V(FBS)∶V(100×双抗)=10∶69∶20∶1为宜.