多重耐药维氏气单胞菌porin基因敲除的构建及其耐药特性研究

目的研究微孔蛋白基因porin对维氏气单胞菌(Aeromonas veronii,A.veronii)耐药性的影响以解析A.veronii的耐药机制。方法以多重耐药的A.veronii WL-3为研究对象,采用同源重组双交换的方法构建Δporin敲除株,利用比浊法测定其生长曲线,通过药敏纸片法分析其耐药性。结果以A.veronii WL-3基因组DNA为模板,利用overlap聚合酶链式反应技术扩增获得上下同源臂融合片段,并连接至自杀质粒pDM4中,重组成敲除质粒pDM4-Δporin。将pDM4-Δporin转化至感受态大肠杆菌SM10中,通过接合转移转入A.veronii WL-3中。通过同源重组双交换构建A.veronii WL-3Δporin敲除株。生长曲线显示与野生株相比,Δporin菌株的生长速度并无明显变化;抗生素耐药特征分析显示敲除porin基因会降低A.veronii对头孢氨苄、新霉素、四环素、环丙沙星等10种抗生素的敏感性,提高对多粘菌素B的敏感性。结论基因porin不是A.veronii生长所必需的,但会影响A.veronii对部分抗生素的敏感度。本研究所构建的敲除株可为深入研究porin在A.veronii的耐药机制提供必要材料。

浙江地区奈瑟淋球菌临床菌株porinⅠ基因优势型及原核表达系统的构建

目的分析浙江地区奈瑟淋球菌临床菌株porinⅠ基因优势型分布情况,构建porinⅠA与porinⅠB基因的原核表达系统。方法在先前研究的基础上,对确定的porinⅠA和porinⅠB基因进行T-A克隆后测定核苷酸顺序,分析porinⅠA和porinⅠB的地区优势基因型。再构建porinⅠA和porinⅠB基因优势基因型的原核表达系统,0.5 mmo L/L IPTG诱导后,10%SDS-PAGE检测蛋白表达情况。结果测序的5株porinⅠA全为血清型ⅠA-6;测序的11株porinⅠB中,血清型ⅠB-3有5株,血清型ⅠB-3/6有3株,血清型ⅠB-6有1株,其余2株为变异株。构建的原核表达系统PET-42-PⅠA的PⅠA表达量占细菌总蛋白量的30%;PET-42-PⅠB的PⅠB表达量占细菌总蛋白量的20%。结论浙江地区奈瑟淋球菌临床菌株porinⅠA以血清型ⅠA-6为优势基因型,porinⅠB以血清型ⅠB-3为优势基因型,porinⅠA相对于porinⅠB而言更加保守。所构建的原核表达系统能高效表达PⅠA与PⅠB重组蛋白。

淋病奈瑟菌临床菌株PⅠ基因型及PⅠB基因点突变分析

目的分析浙江地区淋病奈瑟菌株外膜孔蛋白PⅠ基因序列及其点突变与耐药性关系,了解本地区淋病奈瑟菌株PⅠA与PⅠB基因分布及其优势基因型。方法采用高保真PCR扩增34株淋病奈瑟菌全长PⅠ基因序列,T-A克隆后测序。根据测序结果,建立多重PCR同时检测113株淋病奈瑟菌PⅠA和PⅠB基因。分析测序菌株PⅠB基因中与耐药性密切相关的G120和A121变异情况,采用二倍琼脂稀释法确定PⅠB菌株的耐药性。结果11株PⅠA+淋病奈瑟菌均为ⅠA6血清型。23株PⅠB+淋病奈瑟菌中,6株(26．1％)为ⅠB3血清型、5株(21．7％)为ⅠB3／6血清型、2株(8．7％)为ⅠB4血清型、9株(39．1％)为ⅠB3／6-ⅠB2嵌合血清型、1株(4．3％)为ⅠB2-ⅠB4嵌合血清型。所建立的多重PCR可特异和准确地对PⅠA和PⅠB基因分型,检测灵敏度为10 ng DNA模板。113株淋病奈瑟菌中,26株(23．0％)和87株(77．0％)分别携带PⅠA和PⅠB基因。经测序的23株PⅠB+淋病奈瑟菌中,1株(4．3％)G120和A121均未突变,3株(13．0％)G120或A121突变,2株8．7％)G120突变但A121缺失,17株(73．9％)双位点突变。22株G120和／或A121突变的PⅠB+菌株均对青霉素和四环素耐药。结论所建立的多重PCR可用于淋病奈瑟菌PⅠA和PⅠB基因的分型检测。本地区流行的淋病奈瑟菌主要携带PⅠB基因。ⅠA6为PⅠA菌株优势血清型。PⅠB菌株以ⅠB3／6-ⅠB2嵌合、ⅠB3和ⅠB3／6血清型常见,但主要为耐药性G120和,或A121突变株。