凹叶厚朴低温胁迫SSH文库的构建及差异基因的表达分析

[目的]通过凹叶厚朴差减文库的构建及序列分析,找出其主要抗寒相关功能基因。[方法]随机挑选单克隆菌落进行PCR检测,对837个阳性克隆测序后进行拼接得到97个unigenes,将97个unigenes在NCBI进行BLAST比对,后进行BLAST2GO功能分类,推定出11个相关基因进行荧光定量PCR。[结果]CHS、APX、TRX、ERF、DREB、LHCB、WRKY、HSP、PP2C、GAPDH 10个基因在凹叶厚朴受到低温侵害时出现差异表达,推断这10个基因在低温时可能表现出防御机制。[结论]该研究为与凹叶厚朴亲缘关系相近的植物抗低温特性遗传育种提供理论基础。

香蕉叶片低温胁迫下差异表达cDNA消减文库的构建

为了解析香蕉寒害的分子机理,应用抑制性消减杂交技术(suppression subtractivehy bridization,SSH)成功构建了香蕉叶片在低温胁迫下与未处理的差异表达的cDNA消减文库,并通过经蓝、白斑筛选,克隆测序及序列分析,以及应用半定量PCR技术对随机选取的No.28基因片段进行表达分析等方法,初步分析了实验所构建的cDNA消减文库。结果表明,实验所构建的cDNA消减文库为低温胁迫特异表达的cDNA消减文库;测序及序列分析的结果暗示可能有相当多的未知功能基因参与了香蕉抗寒的过程;随机选取的No.28的表达分析检测结果证实,通过对构建的cDNA消减文库的全面分析,有可能获得一批低温胁迫诱导特异表达的新基因,尤其对其功能的深入了解,将为全面解析香蕉寒害的分子机理、寒害过程中的信号转导打下理论基础。

马铃薯块茎低温反应抑制差减文库的构建及鉴定

以4℃(Tester)和20℃(Driver)处理的马铃薯野生种Solanum berthaultii的无性系CW2-1块茎为材料,构建马铃薯块茎低温反应抑制差减文库以进一步筛选差异表达基因。通过PCR鉴定后,获得了含有2112个阳性克隆的差减杂交文库。采用反向Northern方法对差减文库进行筛选鉴定,得到274个含有显著表达差异基因(P/N>3)的阳性克隆。从中挑选了53个克隆进行测序和同源比对分析,合并后获得29个代表不同基因的非重复序列片段,表明文库具有较高质量。随机选取其中4个EST进行基因表达分析,结果显示,在耐低温糖化的S.berthaultii块茎中,4℃下贮藏的块茎基因表达强度高于20℃贮藏的块茎;同在4℃贮藏条件下,S.berthaultii和易低温糖化栽培种E1的块茎中基因的表达量亦存在差异,证明所构建的差减文库富集了马铃薯块茎对低温响应的基因。

低温诱导东乡野生稻幼苗期叶片cDNA文库的构建和鉴定

从8℃低温诱导的东乡野生稻幼叶中提取总RNA,以总RNA为模板,利用SMART技术合成第1链,再经LD-PCR扩增合成第2链后,将获得的双链cDNA与双元表达载体YPL3连接,重组质粒电转入大肠杆菌,成功构建了东乡野生稻cDNA文库。经测定,原始文库滴度平均为4.4×107cfu/mL,平均插入片段约1kb,重组率为100%,符合cDNA文库构建要求,为后续利用酵母功能互补技术筛选东乡野生稻有利基因奠定了基础。