人巨细胞病毒pp150-pp65蛋白的表达与应用

目的构建并表达人巨细胞病毒(HCMV)pp150-pp65蛋白,将纯化的重组蛋白制备成胶体金试剂盒对其抗原性进行评价。方法采用PCR方法扩增HCMV pp150-pp65基因片段,连接到原核表达载体pET28a进行表达并纯化,采用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定,并与北京英诺特生物技术有限公司合作研制出巨细胞IgG/IgM抗体联合检测试剂盒(胶体金法),与进口试剂盒(酶免法)进行临床标本比对试验。结果成功构建了HCMV的高效表达载体pET28a-pp150-pp65,并得到分子量在45kd的高表达蛋白,具有良好的抗原性。将该蛋白制备成胶体金试剂盒,经600份血清标本的检测,与进口CMV-IgG试剂盒进行比对,本试剂盒的阳性符合率和阴性符合率分别为92.7%和83.1%,总的符合率为90.2%;与进口CMV-IgM试剂盒进行比对,本试剂盒的阳性符合率和阴性符合率分别为88.1%和89.2%,总的符合率为88.5%,稳定性良好。结论高效表达纯化的pp150-pp65重组蛋白抗原性强,利用其建立的胶体金试剂盒与国产已上市试剂盒和进口试剂盒比对,不仅具有较高的灵敏度和特异性,而且经初步临床应用,表明该试剂盒能检测不同临床感染阶段的患者,具有较好的市场前景。

人巨细胞病毒gp52-pp65-pp150的融合表达及应用

目的克隆表达人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)特异性强的抗原决定簇基因,制备并纯化重组蛋白,并通过组装成捕获法ELISA试剂盒对其抗原性进行评价。方法提取人巨细胞病毒AD169株的DNA,用PCR扩增HCMV的pp150(UL32)、gp52(UL44)、pp65(UL83)基因片段,将3个基因片段串联克隆至原核表达载体pGEX-5x-3进行融合表达和纯化,采用SDS-PAGE电泳法和免疫印迹法(Western blot)对融合基因的克隆及重组蛋白的表达进行鉴定,并组装成捕获法ELISA试剂盒对临床标本进行检测,评价试剂盒的各项性能指标。结果经序列测定各基因片段序列正确,成功构建了HCMV的高效表达融合基因的重组载体gp52-pp65-pp150,表达的融合蛋白经Western blot分析,分子量在50 ku,具有良好的抗原性。将该蛋白组装成捕获法ELISA试剂盒,经232份血清标本的检测,与进口试剂盒相比,本试剂盒的灵敏度为93.91%;特异度为97.43%;粗一致性为96.1%;约登指数为0.901;批内变异系数为12.4%;稳定性良好,37℃保存试剂与4℃保存试剂进行对照试验,变异系数为13%。结论本实验通过基因工程技术的方法有效地获取纯度较高、特异性强的HCMV抗原(gp52-pp65-pp150重组蛋白),该融合蛋白构建的捕获法ELISA试剂与进口试剂盒比对,具有较高的灵敏度和特异性,经初步临床应用,具有进一步开发应用的价值,为不同临床感染阶段的HCMV的检测提供了技术基础。