异基因造血干细胞移植后人类巨细胞病毒pp65的监测及疗效、危险因素分析

本研究探讨异基因造血干细胞移植(alloHSCT)后受者外周血白细胞巨细胞病毒(CMV)pp65抗原阳性细胞数的变化及临床意义。以104例HSCT受者为研究对象,采集移植前后及恢复期受者的抗凝血标本,用CMVpp65单克隆抗体荧光免疫组织化学法检测CMV早期抗原,并进行动态观察。结果表明104例HSCT受者中29例移植后检出CMVpp65抗原阳性,检出率27.88%,其中16例为CMV血症,13例为CMV病。29例经抗病毒治疗后25例抗原转为阴性,有效率86.21%,死亡4例,病死率13.79%。CMV感染患者中,受非血缘或单倍体相合异基因HSCT的患者与受同胞全相合异基因HSCT的患者CMV感染率分别为39.29%和14.58%,两者相比较有显著性差异(P<0.05)。0-Ⅰ度急性GVHD组CMV感染的发生率为19.44%,而Ⅱ-IV度急性GVHD组为46.88%,两者间的差异有显著意义(P<0·05)。CMV抗原阳性与阴性患者的急性GVHD发生率有显著性差异(P<0·05)。结论外周血白细胞CMVpp65病毒抗原检测可作为造血干细胞移植后CMV病的监测指标,用于指导移植后抗病毒的治疗和疗效评价。

应用间接免疫荧光技术检测人巨细胞病毒-PP65抗原的临床意义

目的:探讨人巨细胞病毒(HCMV)-PP65抗原检测的临床意义。方法:利用间接免疫荧光技术对本院56例住院患者外周血HCMV-PP65抗原进行检测,其中器官移植组35例(肾移植患者13例,肝移植患者14例,骨髓移植患者8例),其他疾病组21例。设本院健康体检者20例为正常对照组。结果:56例标本中有25例检出HCMV-PP65抗原阳性,阳性率为45%。25例抗原阳性患者中,有临床症状的患者外周血中的HCMV-PP65抗原阳性细胞数明显高于无临床症状的HCMV-PP65抗原阳性的患者,两者比较差异有显著性(P<0.01)。正常对照组无一例阳性。结论:HCMV-PP65抗原检测具有简便、敏感的特点,其结果与患者的临床症状相关,可以作为监测HCMV活动性感染的指标,为临床提供诊治依据。

荧光定量PCR与PP65抗原检测在诊断儿童巨细胞病毒活动性感染的比较

目的用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)和pp65抗原检测儿童人巨细胞病毒(HCMV)感染,并对其诊断HCMV活动性感染进行比较评估。方法分析924例HCMV血清学检测阳性的儿童的全血HCMV-DNA荧光定量PCR及HCMV-pp65抗原检测结果,与临床诊断的符合程度进行比较。结果全血HCMV-DNA荧光定量PCR和pp65抗原检测的一致率为81.17%,其标准误为0.39,Kappa值为0.60;PCR检测HCMV感染的灵敏度为98.4%,特异度为97.3%,Youden指数为0.957,PVP和PVN分别为0.961和0.989;pp65抗原检测用于检测HC-MV感染的灵敏度为59.2%,特异度为100%,Youden指数为0.592,PVP和PVN分别为1.00和0.782。结论全血HCMV-DNA荧光定量PCR和pp65抗原检测的结果有较好的一致性,诊断HCMV感染PCR检测的灵敏度较pp65抗原检测的灵敏度要高,而后者的特异度较前者高。二种方法都可用于CMV活动性感染的诊断。

人巨细胞病毒pp65 IgG-AI快速诊断试剂的临床应用

目的评价人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)pp65 IgG-亲和力指数(Avidity index,AI)快速诊断试剂的临床应用价值。方法以自制的截短pp65重组蛋白作为诊断试剂,对本室血清库中保存的标本,采用ELISA间接法检测其特异性IgG抗体,分析该试剂的灵敏度、特异性和准确度。检测临床收集的89份患者血清标本(其中5例被明确诊断为HCMV活动性感染)的pp65 IgG抗体,并与意大利DIESSE公司IgG检测试剂盒结果进行比较。同时,对pp65 IgG阳性标本,运用尿素变性ELISA间接法检测其AI值,与意大利DIESSE公司IgM检测试剂盒结果进行比较,评价AI检测在HCMV感染诊断中的价值。结果用pp65快速诊断试剂检测阳性、阴性血清特异性IgG抗体,均与原确认结果相同,灵敏度、准确度和特异性均达100%。两种诊断试剂IgG抗体检测结果,差异无显著意义。pp65诊断试剂对pp65 IgG阳性标本的AI值进行检测,AI<60%标本共41份,阳性率为46.07%,较参比试剂IgM检测阳性率(23.59%)高;5份明确诊断HCMV活动性感染的患者血清标本中,pp65诊断试剂与参比试剂检测IgG抗体,各有4份阳性,一致率为100%,pp65诊断试剂检测AI值为阳性的标本有3份,其中,参比试剂检测IgM为阳性的仅有1份。临床明确诊断为HCMV肺炎的患者血清标本,诊断试剂检测AI值为可疑阳性,但参比试剂检测HCMV IgM抗体为阴性。结论pp65 IgG-AI快速诊断试剂可初步诊断HCMV感染,简单快速,重复性好,具有良好的临床应用前景。

肾移植受者外周血循环中pp65阳性内皮细胞的新模式

目的 :为观察感染人类巨细胞病毒 (HumancytomegalovirusHCMV)的 1例女性肾移植受者外周血中膨大内皮细胞 (Cytome galicendothelialcells ,CEC)的一种新模式。方法 :本研究运用了HCMVpp65抗原分析法、实时PCR技术、流式细胞分析法等系列技术。结果 :发现在一围绕并粘附了许多白细胞的蛋白样物质内 ,含有几个pp65阳性的CEC。这种蛋白质样物质的成分和功能目前还不清楚。该患者外周血中出现CEC表明其血管有损伤 ,而且该患者的CD4+ 及CD8+ 淋巴细胞的百分比都超出正常范围。其血浆、外周血白细胞及尿液中的HCMV DNA都阳性 ,但该患者并没有明显的HCMV病症状。结论 :HCMV感染和CEC形成之间的关系需进一步研究。

人巨细胞病毒截短被膜磷蛋白pp65的原核表达及抗原性分析

目的利用大肠杆菌表达系统表达截短人巨细胞病毒(HCMV)pp65蛋白,并对其抗原性进行初步鉴定。方法采用PCR扩增HCMV pp65基因961～1 686 bp(321aa-562aa)片段,并将其插入表达载体pET30a(+),转化BL21(DE3)菌株,十二烷基硫酸钠—聚丙稀酰胺凝胶(SDS-PAGE)分析蛋白表达,常规镍柱法纯化目的蛋白,以ELISA法初步检测其抗原性。结果获得相对分子质量约为30 kD的融合蛋白,pp65抗原和全病毒抗原的P/N值分别为2.737、2.535。结论本研究成功表达截短HCMV pp65抗原,并证实其蛋白抗原性优于全病毒抗原;此为HCMV检测试剂盒的研制和疫苗的研究提供了依据。

HCMVpp65抗原和IgM抗体检测诊断儿童HCMV活动性感染的比较

目的:比较人巨细胞病毒(HCMV)pp65抗原(以下简称pp65)检测和血清HCMV-IgM抗体(以下简称IgM抗体)检测两种方法对儿童HCMV活动性感染的诊断实用意义。方法:采集临床疑似HCMV活动性感染儿童血标本(共251份),分离血浆和多形核白细胞,分别用于IgM抗体检测和pp65检测。同时进行荧光定量PCR检测HCMVDNA,与pp65抗原作平行比较。结果:pp65抗原检测的结果与IgM抗体检测的符合率为73.3%。与HCMVDNA检测相比pp65抗原检测法的符合率、特异度和敏感度分别为85.5%,85.2%和86.2%。而且高pp65抗原血症与患者的临床症状密切相关。结论:pp65抗原血症反映该病毒活动状况,可监测HCMV活动性感染。由于儿童患者还存在原发感染的可能性,所以,联合HCMV-IgM的监测来提高临床的诊断率。

人巨细胞病毒pp65特异性抗体测定在原发感染诊断中的应用

目的通过测定患者单份血清人巨细胞病毒(HCMV)pp65特异性IgM抗体和IgG亲和指数(AI),建立HCMV原发感染的临床判断标准。方法从临床收集40份患儿血清和尿标本,以本室自制的pp65为抗原,运用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清标本中HCMVpp65特异性IgM抗体;同时通过尿素变性实验,以6M尿素作为温和蛋白变性剂,测定HCMVpp65IgGAI。尿标本常规处理后接种人胚成纤维(HF)细胞进行病毒分离,观察HCMV特异性细胞病变效应(CPE),聚合酶链反应(PCR)试验检测细胞培养物UL83基因,间接免疫荧光试验检测细胞玻片HCMV抗原。并将病毒分离结果同血清学方法进行比较。结果40例标本中,IgM阳性13例,IgG阳性30例,其中,仅IgM阳性4例,病毒分离结果亦为阳性,可诊断为原发感染;30例IgG阳性标本中,2种抗体均为阳性9例(A组),其中,5例AI<50%,病毒分离结果均为阳性,判断为原发感染;1例AI在50%与60%之间,为可疑原发感染,需要进一步鉴定;3例AI>60%,判断为继发感染。IgG阳性21例(B组),其中仅3例(14.29%)AI<50%,但病毒分离结果为阴性,提示患者不久前曾发生HCMV原发感染,特异性IgM抗体已经转阴,病毒进入潜伏状态;余18例患者AI均>60%,判断为继发感染;2种抗体均为阴性的标本有6例,病毒分离结果亦为阴性,说明患者未被感染。统计学分析,A组与B组之间差异有统计学意义(P<0.05)。血清学方法与病毒分离比较,一致率为75.49%,该方法灵敏度为100%,特异度为87.10%,准确度为90.00%。结论以HCMVpp65重组蛋白为抗原检测特异性抗体以及相应IgGAI的ELISA,可快速诊断HCMV原发感染和继发感染;该方法具有高度特异性与敏感性,操作简便,重复性好,具有良好的临床应用前景。

流式细胞术分析HCMV—PP65抗原在外周血各有核细胞群上的表达及意义

目的研究分析人外周血有核细胞感染人类巨细胞病毒PP65抗原（Human Cytomegalovirus PP65 antigen，HCMV—PP65Ag）的阳性表达率及临床意义。方法应用流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）对广州军区广州总医院2007年1月～2008年12月共256例患者的外周血有核细胞HCMV—PP65Ag阳性表达百分率进行分析，其中移植组80例，肿瘤组48例，肾功能不全组86例，其它疾病组42例；设门诊健康体检者20例为正常对照组。对HCMV检出阳性患者根据并发细菌感染与否分为两组，观察两组间临床治疗方案的选择。另对26例HCMV现症感染患者进行连续四周检测，动态观察HCMV—PP65Ag的表达与临床症状的关联。结果256例患者共检出144例HCMV—PP65Ag阳性；HCMV-PP65Ag阳性患者中并发细菌感染与无细菌并发感染两组临床发热娃状及临床用药方案间比较差异均有统计学显著性意义（均P〈0．05）。动态观察组监测结果显示，持续HCMV—PP65Ag检测阳性患者，尤其是粒细胞群表达阳性时，临床多表现有发热症状及易并发细菌感染。结论运用FCM检测人外周血有核细胞表面HCMV—PP65Ag，能快速、准确、有效地提供HCMV感染依据；而对HCMV感染的各细胞群进行分析，有利于临床了解疾病情况和制订治疗方案。

人巨细胞病毒pp65抗体检测方法的建立

目的建立检测人巨细胞病毒pp65IgG抗体（HCMV pp65 IgG）的间接酶联免疫吸附试验（ELISA）。方法通过棋盘滴定法选择包被抗原和酶标二抗的最适浓度：以商品抗HCMV pp65单抗为阳性模拟标本，建立检测抗HCMV pp65 IgG抗体，并对临床收集的各类血清标本进行检测和分析。结果检测间接ELISA HCMV pp65 IgG的最佳包被抗原浓度为10ng／孔，酶标二抗的工作浓度为1：3000。当阳性吸光度似）值为0．298时，87份不同组的血清标本（HCMV感染活动组、HCMV感染不活动组、HCMV未感染组）阳件检出率分别为51．6％（16／31）、12．1％（4／33）和0．0％（0／23）。3组两两间差异均存在显著性（P〈0．01）。结论本研究建立了检测HCMV pp65抗体的方法，应用该方法能从相应人群中检出该抗体，检测不存在假阳性，并发现该抗体与抗HCMV IgM的检出有关。

HCMV（pp65）抗原血症-肝、肾移植术后巨细胞病毒感染监测的分析

目的通过5000次肝、肾移植术后病人外周血HCMV（pp65）抗原血症检测结果与用ELISA方法检测HCMV特异性IgM、IgG抗体的检测结果进行比较和观察，探讨各种检测方法在检测器官移植术后HCMV感染中的作用。方法应用间接免疫荧光方法，检测2002年1月至2004年11月在我院接受肝、肾移植手术后病人外周血白细胞内人巨细胞病毒（HCMV）的基质磷蛋白（pp65）共检测血标本5000次，阳性病人应用ELISA方法检测HCMV特异性IgM抗体。结果5000次HCMV（PP65）抗原血症检测中，阳性1053次，占21．06％；1053次HCMV（PP65）抗原血症阳性病人，ELISA方法检测HCMV特异性IgM抗体，103次出现阳性。1053次HCMV（PP65）抗原血症阳性病人中约85．23％出现HCMV感染的症状及HCMV病。结论HCMV（PP65）抗原血症检测与其它检测HCMV方法相比，可以早期、快速、准确的检测出肝、肾移植术后病人巨细胞病毒感染，为临床抗病毒治疗提供依据，使HCMV病的发生率明显降低。

HCMV PP65抗原核酸适配子的筛选及活性鉴定

目的以人巨细胞病毒HCMV PP65抗原为靶分子,筛选与其有高亲和力、高特异性的适配子。方法采用SELEX技术筛选HCMV PP65抗原特异的适配子,进行亲和性检测以及二级结构预测,以筛选获得的最优序列作为捕获适配子,建立基于"磁珠-适配子-抗原-荧光单克隆抗体"的夹心检测方法,实现对PP65抗原的初步检测。结果本实验经过8轮筛选获得6条与靶物质高亲和性,高特异性结合的适配子。结论适配子的成功筛选,为建立基于适配子检测HCMV PP65抗原的新方法奠定了基础。

习惯性流产孕妇巨细胞病毒pp65抗原检测的临床意义

目的:探讨人巨细胞病毒(HCMV)活动性感染与习惯性流产(RPL)的关系。方法:采集习惯性流产孕妇和正常产前体检孕妇外周血,分离外周血单个核细胞(PBMCs)和血浆,分别用免疫荧光法和实时定量PCR检测HCMV pp65抗原和HCMV-DNA,并比较2种方法的一致性。结果:46例RPL患者HCMV pp65抗原有14例阳性,阳性率30.4%,50例正常体检孕妇HCMV pp65抗原有4例阳性,阳性率8%,2组孕妇HCMV活动性感染率有显著性差异(2χ=6.76,P<0.01)。孕妇HC-MV pp65抗原阳性率升高,孕妇流产几率增加(2χ=6.39,P<0.01)。免疫荧光法和实时定量PCR有较好的一致性(93.5%)。结论:习惯性流产孕妇HCMV活动性感染率显著高于正常孕妇,HCMV pp65抗原检测可作为RPL早期诊断指标之一。

儿童抽动-秽语综合征HCMV pp65抗原检测的临床意义

目的探讨儿童巨细胞病毒(Hum an cytom egalov irus,HCMV)活动性感染与抽动-秽语综合征(T ourette’s sym-drom e,TS)的关系。方法离心分离64例抽动-秽语综合征患儿和40例正常儿童外周血单个核细胞(PBM C s)和血浆,分别用免疫荧光法和定量PCR检测HCMV pp65抗原和HCMV DNA,并比较2种方法的一致性。结果64例TS患儿HCMV pp65抗原有14例阳性,阳性率21.9%,40例正常儿童HCMV pp65抗原有1例阳性,阳性率2.5%,2组儿童HCMV感染率有显著性差异(2χ=7.49,P<0.01)。免疫荧光法和实时定量PCR有较好的一致性(89.1%)。结论抽动-秽语综合征儿童HCMV感染率显著高于正常儿童,HCMV活动性感染可能诱发抽动-秽语综合征。

外周血白细胞HCMV PP65抗原检测结果分析

目的分析外周血白细胞巨细胞病毒(HCMV)PP65抗原检测结果,总结儿科常见疾病的HCMV感染情况及HCMV感染所致临床疾病的分布情况。方法采用间接免疫荧光法检测了1016例儿童外周血白细胞HCMVPP65抗原,对检测结果及阳性病例进行分析。结果所有送检标本总阳性检出率为25.2%,以肝炎、婴儿肝炎综合征组患儿阳性检出率最高,分别为37.8%、32.4%。CMV感染可累及全身各个系统,引起疾病多样,但以婴儿肝炎综合征最多见(37.1%),其次为高胆红素血症(12.9%)、急性呼吸道感染(10.9%)、腹泻(9.4%)、发热待查(6.6%)、肝炎(5.5%)等。结论HCMV感染临床上常见,症状多样,临床医生对可疑病例应及早作相应的实验室检查,以助于早期临床诊断,并指导有效的治疗。

CMVPP65抗原监测无关供体造血干细胞移植后巨细胞病毒感染

目的利用免疫荧光组化方法对CMV-PP65抗原进行监测,探讨无关供体造血干细胞移植后CMV的感染率,危险因素和治疗情况。方法以37例无关供体造血干细胞移植患者为研究对象,移植14d后每周采集受者的抗凝血标本直到移植后3个月,之后每隔1～3个月采集一次受者的血标本直到移植后3年,3年后仍有CMV再次感染者继续采集患者标本,并进行动态观察。结果1、在2～50个月的随访期内,CMV首次检出的中位时间在50d,CMV病毒血症发生率59.46%(22/37)。严重GVHD患者和无严重GVHD患者CMV感染率无明显差异;2、CMV病毒血症患者对早期抗病毒治疗有效,CMV疾病发生率很低。结论无关供体造血干细胞移植后长期坚持CMV监测非常必要,有助于指导CMV病毒感染的治疗和预后评价。

巨细胞病毒定量PCR与pp65抗原测定监测异基因造血干细胞移植巨细胞病毒感染的比较

本研究比较巨细胞病毒(CMV)定量PCR检测和CMV-pp65抗原检测在异基因造血干细胞移植CMV感染中的诊断价值。以84例异基因造血干细胞移植患者为研究对象,自预处理开始每周对患者EDTA抗凝外周血血标本进行CMV-pp65抗原及CMV定量PCR动态检测,直至出院,比较观察两者在诊断CMV感染中的作用。结果表明:84例移植患者的732份系列血标本中,26例移植后检出CMV定量PCR阳性,检出率30.95%,其中9例为CMV血症,13例为CMV病,检出中位时间为37.1(7-105)天;22例CMVpp65抗原检测阳性,检出率26.19%,检出中位时间为46.6(10-128)天;所有CMV-pp65抗原检测阳性患者CMV定量PCR均为阳性,4例CMV定量PCR阳性但CMV-pp65抗原检测阴性患者均未发展为CMV病。CMV病多出现于CMV定量PCR中等至高拷贝数或中等至高水平病毒血症(CMV-pp65抗原)病例中。治疗后CMV定量PCR转阴中位时间为17.5(11-28)天,CMV-pp65抗原转阴中位时间为10.0(7-21)天。结论:CMV定量PCR和CMV-pp65抗原检测均能作为异基因造血干细胞移植CMV感染早期诊断的有效手段,CMV定量PCR更敏感,CMV-pp65抗原检测更特异,两者同时使用能更有效地提高CMV感染诊断水平,监控其发生发展。

巨细胞病毒pp65抗原检测的新方法

目的传统的检测CMVpp65抗原的方法是间接免疫荧光,操作麻烦,步骤较多,整个实验需要6个多小时,而且只能定性。需要寻找一种简便的可以定量的方法来检测CMVpp65抗原阳性细胞。因此我们设计了流式的方法来检测CMVpp65抗原阳性细胞。方法我们用间接免疫荧光试剂盒中的一抗和购自invitrogen公司的二抗进行了流式标记移植病人外周血中的WBC,操作步骤明显简便了,只需不到2 h就可完成检测,而且可以定量检测CMVpp65抗原阳性细胞。同时我们用荧光定量PCR检测病人尿中的CMV基因的拷贝数。结果流式检测阳性率高的标本,用间接免疫荧光方法检测也为阳性,同时流式检测强阳性的病人尿用荧光定量PCR检测到CMV基因,表明病人处于CMV病毒血症。结论我们用间接免疫荧光试剂盒中的一抗和购自invitrogen公司的二抗进行流式标记,成功检测了移植病人的CMVpp65抗原阳性细胞的百分比,新方法可以定量,与荧光定量PCR方法检测病人尿中的CMV基因的结果符合率较高,可以推广应用。

人巨细胞病毒PP65抗原单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备人巨细胞病毒(human cytomegalic virus,HCMV)PP65抗原的单克隆抗体,并通过免疫组化鉴定单克隆抗体与HCMV PP65抗原的反应性。方法诱导PQE30-PP65重组质粒表达PP65蛋白并Ni柱亲和层析纯化。PP65抗原免疫BALB/c小鼠,将血清抗体阳性小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合,经HTS筛选,扩大培养获取单克隆抗体。经Protein A亲和层析纯化,并通过间接ELISA鉴定其特异性、效价及亚型。将制备的单克隆抗体应用于临床样本的玻片免疫组化检测。结果获得8株高特异性抗HCMV PP65抗原的单克隆抗体,其亚型均为IgG1型,轻链均为κ链,效价均在1∶2048000以上。其中6株单克隆抗体能够通过玻片免疫组化法准确鉴定HCMV激活性感染。结论成功制备了HCMV PP65单克隆抗体。单抗与白细胞中HCMV PP65抗原反应良好。

肾移植受者外周血白细胞CMV抗原阳性细胞数及意义

【目的】探讨肾移植受者外周血白细胞巨细胞病毒 (CMV)PP 6 5抗原阳性细胞数的变化及意义。【方法】用免疫细胞化学法检测外周血白细胞CMV PP6 5抗原 ,术后头 3个月每周 1次。【结果】 2 73例肾移植受者中 12 4例术后检出CMV PP6 5抗原阳性 ,初次检出CMV PP6 5抗原的平均时间为 ( 2 4 1± 11 3)d ,每 5万白细胞中CMV抗原阳性细胞数均值为 7 1± 5 8,其中 5例CMV抗原阳性细胞数超过 10 /5万白细胞。无症状性和症状性CMV感染受者初次检出CMV抗原阳性细胞数分别为 ( 6 7± 5 6 ) /5万白细胞、( 10 1± 9 3) /5万白细胞 (P >0 0 5 ) ;峰值水平为 ( 8 1± 4 2 ) /5万白细胞、( 2 6 3± 5 7) /5万白细胞 (P <0 0 5 ) ;分别有 17例 ( 15 % )、12例 ( 10 0 % )患者其峰值超过 10 /5万白细胞 (P <0 0 5 )。抗病毒治疗中 90例( 72 6 % )患者CMV抗原阳性细胞数进一步升高。【结论】肾移植受者在CMV感染早期病毒复制能力强 。