肠出血型大肠埃希菌O157:H7 ppk基因缺失株的构建及其生物学特性分析

目的利用Red重组系统构建肠出血型大肠埃希菌(EHEC)O157:H7 ppk基因缺失株,并研究其生物特性。方法设计并合成一对同源臂引物,每条引物5'端与ppk基因同源,3'端与卡那霉素抗性基因同源,扩增卡那霉素抗性基因片段;制备含有pKD46质粒的EHEC O157:H7 EDL933w感受态细菌,然后将该抗性基因片段电击转化入制备的感受态菌株中;利用pKD46介导的Red重组系统,通过同源重组替换EHEC O157:H7 EDL933w ppk基因,PCR和测序验证;通过革兰染色、测D600值、吉姆萨染色比较EHEC O157:H7 EDL933w野生株和突变株的形态结构、生长能力和黏附性。结果构建了ppk基因缺失并含有卡那霉素抗性的EHEC O157:H7 EDL933w突变菌株(EHEC O157:H7 EDL933wΔppk),初步探索了EHEC O157:H7 EDL933w野生株和突变株的生物学特性。结论本研究运用Red重组系统构建了肠出血型大肠埃希菌O157:H7 ppk基因缺失株,为进一步研究肠出血型大肠埃希菌中ppk基因的调控机制奠定了基础。

Pseudomonas putida GM6多聚磷酸盐激酶(ppk)基因的克隆及表达

以一株高效聚磷菌Pseudomonas putidaGM6为研究材料。为获得其多聚磷酸盐激酶(polyphos-phate kinase,ppk)基因,并验证该基因在磷酸盐转运系统中的作用,根据已报道的ppk基因保守区域设计引物,从其总DNA中成功扩增到ppk基因的部分片段(约528 bp)。随后采用快速染色体步移方法(Self-formed adap-tor PCR,SEFA-PCR)技术扩增片段的上下游基因序列,将三个序列拼接,用OMIGA软件分析其ORFs,推测ppk基因全长为2 220 bp(GenBank accession number DQ133537)。构建的多聚磷酸盐激酶表达菌株E.coliBL21(DE3)/pET29a-ppk经IPTG诱导后3 h时,明显出现分子量约为81 kDa的表达产物。且表达菌株在12 h时的磷去除率高达80%(对照菌株的磷去除率仅为18%),远高于已报道的40%的去除率。这表明ppk基因在E.coli中的过量表达,导致了E.coli菌体中poly-P的大量聚集,从而大大去除了培养基中的磷酸盐。

ppk1基因缺失对产ESBLs尿路感染大肠埃希菌药物敏感性的影响

探讨ppk1基因缺失对产超广谱β-内酰胺酶尿路感染大肠埃希菌(ESBLs-UPEC)药物敏感性的影响及其作用机制。本课题为实验性研究,2021年3至4月期间从广州医科大学附属市八医院检验科临床尿路感染患者尿液标本中分离1株产超广谱β-内酰胺酶(耐药基因型为TEM合并CTX-M-14型)的大肠埃希菌,命名为UE210113,并采用自杀质粒同源重组技术构建ppk1基因敲除株Δpk1并同时构建回补株Δpk1-C,用于开展研究ppk1基因对ESBLs-UPEC药物敏感性的影响及作用机制。使用Vitek2 Compact和微量肉汤稀释法分别检测UE210113、Δpk1及Δpk1-C对抗菌药物的敏感性;同时采用实时荧光定量PCR法对UE210113、Δpk1及Δpk1-C的ESBLs、外膜蛋白以及主动外排系统基因进行定量分析。通过两独立样本秩和检验,药物敏感性实验结果显示,与UE210113相比,Δpk1对头孢他啶、头孢吡肟、妥布霉素、米诺环素和复方新诺明的敏感性增强(Z=-2.121,P<0.05;Z=-2.236,P<0.05;Z=-2.236,P<0.05;Z=-2.121,P<0.05),Δpk1-C的药敏性恢复与UE210113一致(Z=0,P>0.05);实时荧光定量PCR法检测耐药性相关基因的结果显示,Δpk1中编码ESBLs基因bla_(TEM)和bla_(CTX-M-14)表达量较UE210113明显下调,但在Δpk1-C未恢复表达;外膜蛋白基因omp F在Δpk1中的表达明显上调而omp A、omp C则表达下调,主动外排系统基因tol C、mdt A和mdt G在Δpk1中的表达相对下调,外膜蛋白和主动外排系统基因在Δpk1-C均能恢复表达。综上,ppk1基因的缺失影响了ESBLs-UPEC的外膜蛋白基因和主动外排系统蛋白基因的表达,使ESBLs-UPEC对多种药物的敏感性提高。

MUCT短程硝化和反硝化除磷系统中Candidatus Accumulibacter的代谢活性和菌群结构

采用实现亚硝酸型硝化的MUCT工艺处理低C/N实际生活污水,在短程硝化的基础上实现反硝化除磷.研究短程硝化建立与破坏过程中,亚硝酸盐积累率的变化对系统除磷性能及CandidatusAccumulibacter菌群结构的影响.结果表明:MUCT除磷以反硝化除磷为主,平均反硝化除磷率高达88%.磷去除率与亚硝酸盐积累率具有很好的正相关性.短程硝化阶段磷的平均去除率比全程硝化阶段高30%以上,证明了亚硝酸盐更适合作为低C/N比污水反硝化除磷的电子受体.以多聚磷酸盐激酶基因(ppk1)作为遗传标记,采用实时荧光定量PCR方法考察不同亚硝酸盐积累率下Accumulibacter的丰度、各主要进化分支的菌群结构和相对丰度.当系统处于全程硝化状态时,存在少量以硝酸盐为电子受体的Acc-I型反硝化聚磷菌,低于总Accumulibacter的5%;当系统进入短程硝化状态后,Acc-I逐渐消失.运行期间以亚硝酸盐作为电子受体进行反硝化除磷的Acc-IID始终是优势聚磷菌,达到总Accumulibacter的92%以上,甚至接近100%,保证了亚硝酸型反硝化除磷的稳定运行,亚硝酸盐浓度是影响其丰度变化的重要因素.

城市污水处理厂Candidatus Accumulibacter的菌群结构及定量分析

Candidatus Accumulibacter是污水生物除磷系统中的优势聚磷菌.本研究采用编码聚合磷酸盐激酶的功能基因(polyphosphate kinase 1gene,ppk1)作为遗传标记,对9个污水处理厂共12个活性污泥样品中Accumulibacter的进化枝水平的丰度及其菌群结构进行了研究.实时定量PCR(Quantitative PCR,QPCR)的结果显示,Accumulibacter的6个进化枝(IA、IIA、IIB、IIC、IID、IIF)均存在于12个污泥样品中.A2O及其改良工艺中总Accumulibacter丰度最高,达到总菌的22.77%.所有样品中Accumulibacter均以Type-II为主,其中,IIC、IID的丰度均达到了108cells·g-1(以MLSS计),占Accumulibacter的平均比例分别为75.34%和14.87%,是污水处理厂中的优势聚磷菌.分支IA丰度最低,占总Accumulibacter比例平均只有0.32%.系统发育分析结果显示,每个样品中Accumulibacter分支多样化,均含有IIA、IIC、IID分支.QPCR和系统发育分析都证实了生物除磷效果与Accumulibacter的群落结构密切相关,除磷效果不好可能和IID占总Accumulibacter比例较高有关.