转pprI基因油菜对^(133)Cs或^(88)Sr胁迫的响应

通过露地盆栽试验,研究了转基因和非转基因油菜幼苗对土壤中不同浓度的133Cs或88Sr单一胁迫的生理响应。结果表明,在不同浓度的133Cs或88Sr处理时,随处理浓度的增加,不管是转基因还是非转基因油菜,其幼苗对133Cs或88Sr的吸收量都增加,其中二者根部的33Cs或88Sr含量均大于地上部分的含量,同时二者根部对88Sr的吸收大于对133Cs的吸收。但是转基因植株根系吸收133Cs或88Sr的含量大于非转基因油菜根系吸收量,转基因油菜地上部分的133Cs或88Sr含量却小于非转基因油菜地上部分的含量,表明转基因油菜根系更易于吸收和固着133Cs或88Sr,并向地上部分进行运输。随核素浓度增加,非转基因和转基因油菜苗叶片中的丙二醛含量逐渐增加,根系活力均表现为不断减弱,幼苗叶片的可溶性蛋白、POD和SOD活性都呈现先上升后下降的趋势;但在相同浓度的133Cs或88Sr处理后,转基因油菜的丙二醛含量总低于非转基因油菜,转基因油菜的可溶性蛋白含量、POD和SOD活性均高于非转基因油菜,同时转基因油菜的根系活力也略高于非转基因油菜。研究表明:转pprI基因油菜比非转基因油菜具有更强的应对133Cs或88Sr胁迫的抗性能力。本研究为进一步研究pprI基因的调控机理及该基因对137Cs成90Sr协迫响应提供理论和实验基础。

耐辐射球菌pprI基因真核表达载体的构建及其抗辐射作用

目的 研究耐辐射球菌pprI原核基因的真核表达载体的构建及其转染对离体真核细胞急性放射损伤的防护作用.方法 应用DNA重组技术构建pEGFP-c1-pprI质粒;采用脂质体转染技术分别将空载体质粒pEGFP-c1和重组质粒pEGFP-c1-pprI转入人肺上皮细胞系Beas-2B细胞,筛选稳定转染细胞系;应用集落形成实验检测受照转染细胞的生存能力;流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率的变化;荧光显微镜观察受照细胞ROS荧光强度;免疫荧光实验观察受照细胞不同时间γ-H2AX焦点数目.结果 成功地构建了pprI原核基因的真核表达载体,并在Beas-2B细胞中表达了PprI融合蛋白,建立了稳定转染细胞系.与空白对照组和空载体组相比,细胞克隆生存曲线显示转染了pprI基因的Beas-2B细胞经不同剂量辐射,其存活分数SF增加,该曲线参数D0、Dq、N增高;转染了pprI基因的Beas-2B细胞受照后的ROS的荧光强度和不同时间（1、2、4 h） γ-H2AX的焦点数均显著减低（F=16.73、19.47、6.94,P＜0.05）;此外,该细胞G2期阻滞（F=139.73、237.92,P＜0.05）和凋亡率显著减低（F=626.02、2 052,P＜0.05）.结论 耐辐射球菌pprI原核基因可在离体真核细胞中稳定表达,并且显著提高受照真核细胞的辐射抗性.

原核pprI基因活体转染对BALB/c小鼠急性放射损伤保护作用的研究

目的 研究耐辐射奇球菌pprI基因活体转染对小鼠急性放射损伤的防护作用.方法 采用SPF级纯品系BALB/c雄性小鼠,应用活体电转染技术,将pEGFP-c1空载质粒及pEGFP-c1-pprI基因重组质粒转入小鼠股前肌肉.应用60Coγ射线进行全身照射,死亡率观察组吸收剂量为6 Gy,观察照后30 d内小鼠死亡率的变化;放射效应观察组吸收剂量为4 Gy,于照后1、7、14、28和35 d观察小鼠外周血象、胸腺、脾脏和骨髓细胞的凋亡率,并于照后第7和28天观察小鼠肺脏和睾丸组织的病理变化.结果 质粒注射剂量为50 μg/50μl,电场强度为200 V/cm时转染肌细胞的效率最高.pEGFP-c1-pprI基因重组质粒转染组小鼠急性辐射死亡率为30％,显著低于单纯照射组（60.0％）和空载体组（63.3％）（x2=4.90、6.24,P＜0.05）.与单纯照射组、空载体组比较,pEGFP-c1-pprI基因重组质粒转染组小鼠的外周血白细胞计数在照后1、7、14和28 d显著增高（F=16.26、8.10、6.37、10.74,P＜0.05）,血小板计数在照后第7和14天显著增高（F=7.36、5.71,P＜0.05）,淋巴细胞百分率在照后7d显著增高（F=18.43,P＜0.05）;胸腺和骨髓细胞凋亡率均在照后第1、7、14、28和35天显著降低（F=3.88、14.91、14.14、39.86、5.65,P＜0.05;F=53.70、11.75、21.78、41.40、4.54,P＜0.05）;脾脏细胞凋亡率在照后第1、7、14和28天显著降低（F=97.95、56.61、33.55、14.71,P＜0.05）.pEGFP-c1-pprI基因重组质粒转染组小鼠肺脏和睾丸的放射病理损伤较轻并且恢复较快.结论 耐辐射奇球菌pprI基因活体电转染对BALB/c小鼠急性放射损伤具有显著的保护作用,为进一步临床应用奠定了实验基础.

耐辐射球菌pprI基因对γ射线损伤小鼠的抗辐射机制

目的 研究耐辐射球菌pprI基因活体电转染在哺乳动物γ射线放射损伤中发挥抗辐射作用的机制.方法 采用雄性昆明种小鼠,随机区组法分为健康对照组、单纯照射组、空载体转染组和基因转染组.将自行构建的含有pprI基因的pCMV-HA-pprI质粒注入接受6 Gyγ射线照射的小鼠肌肉内,然后采用活体基因电转导技术将该基因导入细胞内,应用Western blot法对PprI蛋白及其下游基因recA在哺乳动物细胞中的同源类似物Rad51以及Rad52蛋白表达进行检测.结果 照后1d基因转染组小鼠肌肉组织中PprI蛋白明显表达,7d后未见蛋白表达,其余组小鼠未见蛋白表达；在基因转染组小鼠,肺脏Rad51蛋白于照后第1、7和14天明显表达,明显高于单纯照射组及空载体转染组小鼠,肝脏Rad51蛋白于照后第1天和第28天明显表达,肾脏Rad51蛋白于照后第1天及第14天明显表达；在各组小鼠的肺脏、肝脏组织中检测了Rad52蛋白,其表达无明显规律.结论 耐辐射球菌pprI原核基因成功地在哺乳动物体内细胞表达了PprI蛋白,并作用于下游基因recA在哺乳动物细胞中的同源类似物rad51基因,使其蛋白表达显著增高而发挥其抗哺乳动物辐射损伤的作用.

耐辐射球菌PprI蛋白质表达及其纯化的实验研究

为了在大肠杆菌中高效表达耐辐射球菌PprI融合蛋白并进行纯化,本研究以PCMV-HA-pprI质粒为模板,PCR扩增pprI基因全序列,经Nco I和EcoR I双酶切后定向克隆到pET-28a表达载体中,构建重组原核表达质粒pET-28a-His-pprI,并转入E.coli BL21(DE3)RP。IPTG诱导融合蛋白表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。对蛋白表达优化诱导时菌液的A600值、IPTG浓度、诱导时间和温度表达条件。诱导表达的PprI融合蛋白采用Ni-NTA His-Bind树脂和分子筛两步法进行纯化。结果显示,Western blotting检测的表达产物确为6×His-PprI融合蛋白,相对分子质量约为37 KD。不同诱导浓度、温度和时间在相对分子量为37 KD处见到特异性的PprI蛋白条带具有一定的差异,目的蛋白在上清和沉淀中均有表达。BCA法测得纯化蛋白质浓度为0.15 mg/mL。结果表明,本研究成功构建了耐辐射球菌pprI基因的pET-28a-His-pprI重组原核表达载体,并获得纯化的毫克级耐辐射球菌PprI融合蛋白,为进一步研究PprI蛋白的抗放作用和免疫等性能奠定了基础。

原核pprⅠ基因活体转染对系统性红斑狼疮小鼠氧化应激的影响

目的:通过检测耐辐射奇球菌ppr I基因活体转染系统性红斑狼疮(SLE)小鼠的氧化应激和疾病活动性指标,探讨其对SLE小鼠氧化应激状态的影响。方法:62只纯品系B6. MRL-Faslpr NJU雌性小鼠随机分成3组,未转染组(20只),pEGFP-c1空载体转染组(20只),pEGFP-c1-pprⅠ转染组(22只),纯品系C57BL/6健康小鼠作为健康对照组(20只)。应用活体电转染技术将pEGFP-c1空载体及pEGFP-c1-pprⅠ基因重组质粒转入SLE小鼠股前肌肉。Western blot鉴定转染后SLE小鼠外周血pEGFP-c1和pEGFP-c1-pprⅠ融合基因表达。采用化学比色法检测各组小鼠外周血氧化应激标志物,ELISA法检测抗ds DNA抗体,免疫比浊法检测补体C4和C-反应蛋白。结果:(1)Western blot检测结果提示,质粒转染一周后均能在小鼠体内成功表达,且无毒副作用;(2)与未转染质粒和pEGFP-c1转染组SLE小鼠相比,pEGFP-c1-pprⅠ转染组SLE小鼠GSH含量显著升高(P<0. 01),丙二醛(MDA)、蛋白质羰基(Carbonyls)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量显著降低(P<0. 01),超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性明显升高(P<0. 05),血浆抗ds DNA抗体滴度和CRP含量显著降低(P<0. 01),补体C4明显升高(P<0. 05),与健康组相比,各项指标差异无统计学意义(P>0. 05);(3)与未转染质粒和pEGFP-c1转染组SLE小鼠相比,pEGFPc1-ppr I转染组SLE小鼠淋巴细胞凋亡率和死亡率明显下降(P<0. 01),与健康小鼠相比,差异无统计学意义(P>0. 05)。结论:耐辐射奇球菌ppr I基因活体转染后能在SLE小鼠体内稳定表达且能调节体内的氧化应激状态,降低SLE小鼠的疾病活动度。

镉胁迫对转PprⅠ基因油菜生理生化的影响

利用露天盆栽试验研究了不同浓度Cd胁迫下转PprⅠ基因油菜和野生型油菜对Cd的吸收特性以及生理响应.结果表明:随着Cd胁迫浓度的升高,转基因和野生型油菜对Cd的吸收均显著增加,且二者地下部分的吸收都大于地上部分;在0.5mg/kg Cd处理下,转基因和非转基因油菜对Cd的吸收差异不显著,但1和2mg/kg处理下转基因油菜对Cd的吸收显著低于非转基因油菜.两种油菜对Cd的富集系数和转运系数均随处理浓度的升高而降低;随着Cd浓度的增加,超氧化物歧化酶(SOD)活性呈现先上升后下降的趋势,且在相同处理浓度下,转基因油菜的SOD活性均高于非转基因油菜;丙二醛(MDA)含量呈上升趋势,且其在转基因油菜中的含量均低于非转基因油菜;叶绿素a和叶绿素b的含量随Cd浓度的升高而下降.因此PprⅠ基因的导入,显著降低了油菜对Cd的吸收,提高了其可食部分安全性.