表达乙脑病毒PrM基因重组伪狂犬病病毒的构建

本研究以乙型脑炎病毒SA14-14-2疫苗株基因组RNA为模板,采用RT-PCR一步法扩增了PrM基因的全长cDNA(558 bp),用BamHI和EcoRI双酶切PrM基因的扩增产物,回收目的基因后将其克隆至经同样酶切的伪狂犬病病毒通用转移载体pPgG-uni中,获得了转移载体pPgG-PrM,并对其外源片段进行了测序。序列分析结果表明:与已报道的乙型脑炎病毒SA14强毒株和SA14-14-2疫苗株的核苷酸序列比较,PrM基因的同源性为100%。以伪狂犬病病毒Ea株TK-/gG-/LacZ+突变株为载体构建了一株表达乙型脑炎病毒PrM基因的重组伪狂犬病病毒TK-/gG-/PrM+,为进一步开展猪乙型脑炎与伪狂犬病二价基因工程疫苗的研究奠定了基础。

乙型脑炎病毒XJ/08/01株的分离鉴定及PrM/E基因的遗传进化分析

从新疆维吾尔自治区石河子地区某猪场采集了150份猪脑组织样品,利用RT-PCR方法进行流行性乙型脑炎病毒(JEV)NS1基因扩增,结果有32份组织样品扩增出了430 bp的特异性目的条带。用检测的阳性样品研磨液接种乳鼠进行JEV的分离,经3次乳鼠传代后获得了1株JEV,命名为XJ/08/01。在此基础上,设计引物从接毒乳鼠脑组织样品中扩增JEV的主要抗原基因PrM/E并进行序列分析,结果表明,该分离毒株与JEV疫苗株SA14-14-2的同源性为99.6%,根据基因分型法确定该分离株属于基因Ⅲ型JEV。

我国D2-43病毒株PrM-E基因的重组SFV的制备及生物学鉴定

为构建含PrM E基因的重组SFV病毒 ,将含我国登革 2型病毒PrM E基因的SFV表达载体和辅助载体DNA线性化后 ,进行体外转录 .然后将获得的 2种RNA转录物共转染BHK2 1细胞 ,以RT PCR法证明转染后的细胞培养上清中含有重组SFV .进一步将该重组病毒经蛋白酶激活后可使BHK2 1细胞产生细胞病变 ,并且以间接免疫荧光法在感染细胞内可检测到登革 2型病毒所特有的蛋白 .含我国登革 2型病毒PrM E基因的重组SFV的获得 ,为进一步观察该重组病毒的免疫原性奠定了基础 。

建国后首次登革热暴发分离的2株登革4型病毒prM和E基因序列测定及其系统发生分析

目的对建国后1978年广东佛山首次暴发登革热流行时从患者急性期血液中分离到的两株登革4型病毒(78-42、78-56)进行其分子特征研究并了解其可能来源。方法用Vero细胞培养1978年分离自广东佛山登革热病人的78-42、78-56两病毒株,RNA抽提后RT-PCR法扩增prM、E区基因,克隆至pGEM-TEasy载体后测序;利用DNASTAR软件预测其氨基酸序列并与其他国内外登革4型病毒株序列比较;运用CLUSTALX1.83和MEGA3.1软件绘制系统发生树。结果78-42、78-56两株高度同源,prM、E基因序列和氨基酸序列与其他登革4型病毒同源性很高并证实为登革4型毒株,与印度尼西亚和马来西亚分离株同属基因IIA亚型,核苷酸同源性与印尼ID1973株最高。结论78-42、78-56两新分离病毒株为建国后首次分离到的登革4型毒株,其来源最可能来自印度尼西亚。

登革2型病毒PrM基因的重组甲病毒RNA介导的抗病毒作用的研究

将扩增的登革 2型病毒株PrM基因导入pSFV载体的SP6启动子下游 ,筛选出含该基因正、反向插入的重组质粒DNA。用SpeI酶分别将重组的和辅助的质粒DNA线性化 ,并将其体外转录成 5′末端含帽子结构的RNA。再将这两种RNA共转染BHK细胞。然后将转染的宿主细胞用登革 2型病毒株攻击 ,并分别观察含正、反义PrM基因的重组甲病毒RNA介导的抗病毒效果。通过碱基序列测定 ,筛选出含PrM基因正、反向插入的pSFV PrM重组质粒。并获得了经重组RNA与辅助RNA共转染细胞而产生的重组病毒颗粒。含有反义PrM基因的重组病毒RNA ,在宿主细胞中具有抗登革 2型病毒复制的作用 ,而且强于含正义PrM基因的重组病毒RNA。

登革病毒(NGC株)C与prM全长基因的扩增与克隆

目的 从登革病毒 (NGC株 )中快速分离基因组RNA ,RT -PCR扩增及克隆C和 prM全长基因 ,从而为研究蚊虫细胞对登革病毒的细胞内免疫研究奠定基础。方法 以Trizol试剂从C6 / 36细胞培养上清中提取基因组RNA ,RT -PCR扩增全长C和 prM基因 ,T -A重组入pGEM -T载体 ,重组质粒的双酶切、PCR与测序鉴定。 结果与结论 应用Trizol试剂从蚊细胞培养液上清中快速分离到高纯度和完整登革病毒RNA基因组 ,成功扩增与克隆出全长登革病毒C和

乙脑病毒prM/E基因重组伪狂犬病病毒的构建

以乙型脑炎病毒 SA1 4 - 1 4 - 2株基因组 RNA为模板 ,采用RT- PCR一步法扩增 pr M/ E基因的全长 c DNA(约 2 kb) ,将其克隆至 p MD1 8- T载体 ,获得了克隆质粒 p Tpr M/ E,并对其进行了测序。序列分析结果表明 ,与已报道的 SA1 4 强毒株和 SA1 4 - 1 4 - 2疫苗株的核苷酸比较 ,pr M基因的序列同源性为 1 0 0 %,E发生了 4个点突变 ,其中 1个为回复突变 ,并导致了 3个氨基酸的改变。以伪狂犬病病毒 Ea株 TK- / g G- / L ac Z+突变株为载体 ,构建了 1株乙脑病毒 pr M/ E基因的重组伪狂犬病病毒 TK- / g G- / pr M/ E+。乙脑病毒 pr M/ E基因的克隆及重组伪狂犬病病毒的成功构建 ,为开展乙脑病毒分子生物学及猪猪伪狂犬病一乙脑二价基因工程疫苗的研究打下了坚实基础。

乙型脑炎病毒PrM蛋白原核表达及单克隆抗体制备

目的表达和纯化乙型脑炎病毒Pr M基因的融合蛋白,制备Pr M融合蛋白的鼠源性单克隆抗体(p Ab)。方法根据Gen Bank数据库中乙型脑炎病毒Pr M氨基酸序列获得其对应的基因序列,对Pr M全长基因(80 aa)进行体外合成,将其克隆至p ET-21原核表达载体,构建重组表达质粒p ET21-Pr M;将阳性重组质粒转化大肠杆菌,IPTG诱导表达融合蛋白,通过镍离子亲和层析纯化目的蛋白;纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,获取单克隆抗体并利用Protein A Sepharose柱进行纯化,ELISA法检测抗体效价,Western blot法检测抗体特异性。结果成功构建了p ET-21-Pr M原核表达载体,0.5 mmol/L PTG 30℃培养6 h,原核蛋白Pr M蛋白以包涵体形式在大肠杆菌得到高水平表达,通过复性与亲和层析获得纯度在90%以上的Pr M蛋白,蛋白浓度为600 mg/L,制备的抗Pr M单抗效价高达1:1.6×106,Western blot鉴定其具有良好的特异性。结论获得高纯度乙型脑炎病毒Pr M蛋白,并制备特异性单克隆抗体,将为进一步研究乙型脑炎病毒的生物学功能提供实验基础。

乙型脑炎病毒SA14-14-2株prM基因的克隆与测序

以我国乙型脑炎病毒疫苗株SA14-14-2的基因组RNA为模板,设计1对包含prM基因完整编码区的引物,采用一步法RT-PCR技术扩增其prM基因,扩增出大小约558bp特异性带。将其克隆到pMD18-T载体中,用双脱氧末端终止法进行全序列测定,序列分析表明我国疫苗株SA14-14-2的prM基因核苷酸序列与GenBank收录的完全一致。prM基因的获得为进一步研究该基因的免疫原性以及乙型脑炎病毒基因工程疫苗奠定了基础。

乙脑病毒CN株PrM/E基因的克隆及序列分析

通过RT -PCR扩增乙型脑炎病毒CN株主要抗原基因PrM /E ,并将PrM /E基因克隆、测序后 ,与GenbanK发表的JEVSA14 (U14 16 3)基因序列进行比较分析 ,发现CN株与JEVSA14强毒株的同源性为 98%。在JEV基因组 5′端 4 77～ 2 4 77的长 2 0 0 0nt的决定JEV抗原性的PrM /E区中 ,CN株与SA14株有 4 0个碱基不同 ,其中 2 8个碱基突变为同义突变 ,另外 12个为错义突变 ,导致相应的氨基酸序列 (6 6 6个 )中的 4个氨基酸发生了突变 ,其中有 2个氨基酸出现在含有关键的抗原决定簇的E蛋白内 。

登革病毒prM基因真核表达载体的构建及在白纹伊蚊细胞C6/36中的表达

目的 构建登革病毒prM基因重组表达质粒并在白纹伊蚊细胞C6 / 36中表达。方法 将prM基因亚克隆入真核表达载体 pEGFP -N3,转化大肠杆菌JM 10 9,筛选阳性克隆进行PCR及酶切鉴定 ,将获得的重组质粒以脂质体法转化白纹伊蚊C6 / 36细胞并使其表达 ,利用RT -PCR法检测目的基因的转录 ,Western -blot检测融合蛋白的表达。结果 成功构建了 pEGFP -prM重组质粒 ,RT -PCR证明 prM基因在蚊细胞内的转录 ,Western -blot检测到 prM -GFP融合蛋白的表达。结论 成功构建登革了病毒 prM基因重组表达质粒并在白纹伊蚊细胞C6 / 36中表达 。

PRM1,一个新的候选结肠癌相关CT抗原基因的识别及其在结肠癌组织中的表达分析

目的筛选新的肿瘤/睾丸抗原相关基因,为肿瘤的诊断和治疗提供理论依据。方法利用文献报道的大规模平行信号测序技术获得的人类33种正常组织的基因表达谱,经生物信息学分析筛选出睾丸富集表达基因。利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,在15种人类正常组织中对候选基因进行验证,最后利用荧光定量PCR技术对睾丸特异基因在结肠癌组织和癌旁组织中的表达差异进行分析。结果在15种人类正常组织中,PRM2,PRM1,TNP1,AKAP4,TCP11为睾丸特异性表达,在其它组织中均无表达。其中PRM1基因在50%(6/12)的结肠癌组织中有明显的上调(>2倍)。其它基因在结肠癌中表达与癌旁组织比较无统计学差异。结论PRM1可能是一个新的CT基因,结果显示PRM1基因可能会在结肠癌的分子诊断或者免疫治疗中起到重要作用。

登革2型PrM基因的重组病毒对不同型别登革病毒复制的阻断作用

观察登革 2型PrM基因的pSFV重组甲病毒抗该型病毒的作用 ,进一步探讨登革 2型PrM基因的这种重组病毒对其它 3个血清型登革病毒复制的阻断作用 .采用体外转录和电穿孔 ,分别将构建的含正、反义PrM基因的重组质粒DNA和辅助载体DNA转录成RNA ,然后将这两种RNA共转染BHK细胞 ,进而包装成重组病毒颗粒 .再将激活的重组病毒感染细胞 ,分别用不同型病毒进行攻击 .然后通过免疫荧光法 ,观察对登革病毒复制的阻断作用 .结果表明 ,含登革 2型PrM基因的重组病毒不仅可阻断登革 2型病毒的复制 ,同样具有抑制其他 3个型病毒复制的能力 ,且抗登革 1、4型病毒的复制作用强于抗登革 3型病毒的作用 .用 10 3 TCID50 剂量的登革病毒攻击 ,含反义PrM基因的重组病毒可完全阻断登革 1、3、4型病毒的复制 .但含正义PrM基因的重组病毒对登革 3型病毒的复制不能完全阻断 .

登革病毒转基因载体pB[PUBnls-EGFP-prM]的构建及其在C6/36细胞中整合作用的检测

为利用转基因技术来探索新的蚊媒疾病防治方法 ,将登革病毒前膜蛋白基因prM重组入以转座子piggyBac因子为基础的载体 ,构建了昆虫转基因载体pB[PUBnls_EGFP_prM],在辅助质粒的作用下共同转染白纹伊蚊AedesalbopictusC6 36细胞。PCR和Southernblot证明构建的转基因载体可以将EGFP_prM基因整合入蚊虫基因组中。验证了转座子piggyBac因子、启动子polyubiquitin可以在白纹伊蚊中发挥功能 。

我国D2-43病毒株PrM-E基因的复制型载体质粒DNA的免疫原性(英文)

观察含我国登革 2型病毒株 (D2 4 3)的PrM E基因的复制型SFV(semlikiforestvirus)重组质粒DNA的免疫原性 ,为登革新型疫苗的研制提供依据 .将PrM E基因自T载体上切下 ,插入复制型SFV病毒载体质粒DNA中 .将此重组质粒DNA以电穿孔法导入BHK2 1细胞 ,用间接免疫荧光法在感染细胞内可检测到登革 2型病毒特异蛋白的表达 .采用去除内毒素的质粒提取试剂盒制备重组质粒DNA ,然后以不同剂量通过肌肉多点注射途径免疫Balb c鼠 ,获得的鼠血清可与登革D2 4 3感染的C6 36抗原片起特异的抗原抗体反应 .结果表明 ,含登革 2型病毒PrM E基因的复制型SFV病毒载体质粒DNA在Balb c鼠中可诱导登革 2型病毒特异抗体的产生 ,但抗体水平较低 .

登革3型病毒prM-E基因重组质粒DNA的构建和真核表达

构建登革 3型病毒 prM E基因的真核表达重组质粒 ,并进行体外表达 ,为登革DNA疫苗的研究奠定基础。用RT -PCR法获得 prM -E基因片段 ,然后将其克隆到真核表达载体中。用电穿孔法将重组质粒DNA转入BHK细胞 ,通过免疫荧光法检测外源基因在真核细胞中的表达。结果 ,通过酶切和序列测定证实了构建的重组质粒DNA含序列正确的 prM- E基因。用免疫荧光法检测到转染了重组质粒DNA的BHK细胞的胞浆中有登革 3型病毒特异蛋白的表达。说明含有登革 3型病毒prM -E基因的真核表达重组质粒可以在BHK细胞中表达 ,该结果为观察该重组质粒的免疫原性奠定了基础。

猪乙型脑炎病毒的PrM-E基因克隆与测序

通过RT-PCR扩增乙型脑炎病毒主要抗原基因PrM-E,并将PrM-E基因克隆及测序后,与GenBank发表的SA14-14(M18370)基因序列进行比较分析,发现试验毒株与乙型脑炎病毒SA14-14毒株的同源性为98%。在乙型脑炎病毒基因组决定乙型脑炎病毒抗原性的PrM-E的2 000 bp序列中,试验毒株与SA14-14株有35个碱基不同,但却不影响它的功能。

登革2型病毒43株prM基因片段在痘苗中的克隆与表达

利用RT-PCR技术获得登革2型病毒中国分离株(D_2-43)的prM基因片段。扩增产物经酚:氯仿抽提纯化之后,直接插入pT_7BlueT载体中,经DNA序列分析证明了所扩增片段序列的正确性。构建了痘苗病毒载体PJSA1175/prM,外源基因受痘苗病毒启动子P_(7.5K)的调控。脂质转染(Lipofection)法获得D_2-43株prM蛋白的重组病毒。荧光检测显示,重组痘苗病毒表达的prM蛋白分布于细胞表面。间接ELISA测定其滴度为1:4。

珠江上游地区蚊虫乙型脑炎病毒核酸检测及PrM和E基因序列分析

试验旨在了解珠江上游地区乙型脑炎病毒(JEV)主要传播媒介蚊虫的种类、分布及携带JEV基因型和分子特征。2013年7月在珠江上游地区师宗县采集蚊虫和库蠓标本,并对蚊虫进行分类鉴定;同时采用黄病毒属引物对采集到的蚊虫和库蠓标本进行检测,阳性标本用JEV PrM和E基因特异引物进行扩增、测序,然后采用生物信息学软件进行序列分析。在4个采集点共采集蚊虫3 705只,分别属于库蚊、按蚊、伊蚊和阿蚊4个属的7种蚊虫,牛圈以中华按蚊、骚扰阿蚊为优势蚊种,羊圈以中华按蚊、骚扰阿蚊为优势蚊种,猪圈以三带喙库蚊、中华按蚊和骚扰阿蚊为优势蚊种。采用JEV PrM和E基因特异引物对采集到蚊虫和库蠓标本分162批进行扩增、测序,采用生物信息学软件进行序列分析。结果显示,4株蚊虫携带的病毒均为基因Ⅰ型JEV,与疫苗株SA14-14-2E蛋白存在15个氨基酸差异位点,在8个影响病毒毒力的重要位点上未发生突变。以上结果提示珠江上游地区存在多种蚊虫种类,三带喙库蚊和中华按蚊是该地区的优势蚊种,三带喙库蚊是当地JEV的主要传播媒介,在当地的媒介中存在基因Ⅰ型JEV流行,而流行株的毒力并未降低。

重庆三峡库区2012年乙脑病毒分离株基因序列分析

目的通过分析2012年重庆三峡库区蚊虫中分离乙脑病毒株PrM及E基因序列，揭示毒株的遗传特性。方法对新分离乙脑病毒的PrM及E基因进行PCR扩增，将扩增产物测序。用分子生物学软件进行核苷酸及氨基酸序列分析，并绘制系统进化树。结果新分离的8株乙脑病毒株均为基因I型，与我国其他省市的既往分离株进化关系较近；分离株与减毒活疫苗株SA14—14—2相比较，PrM区核苷酸同源性在85．1％～86．7％之间，氨基酸同源性在95．1％～96．3％之间；E基因区核苷酸同源性在87．6％～87．8％之间，氨基酸同源性在96．9％～97．1％之间。所有新分离株与疫苗株在E基因存在14个氨基酸差异位点。结论2012年8株重庆乙脑分离株为基因I型，在E基因区域与疫苗株相比有部分差异。