我国D2-43病毒株PrM-E基因的重组SFV的制备及生物学鉴定

为构建含PrM E基因的重组SFV病毒 ,将含我国登革 2型病毒PrM E基因的SFV表达载体和辅助载体DNA线性化后 ,进行体外转录 .然后将获得的 2种RNA转录物共转染BHK2 1细胞 ,以RT PCR法证明转染后的细胞培养上清中含有重组SFV .进一步将该重组病毒经蛋白酶激活后可使BHK2 1细胞产生细胞病变 ,并且以间接免疫荧光法在感染细胞内可检测到登革 2型病毒所特有的蛋白 .含我国登革 2型病毒PrM E基因的重组SFV的获得 ,为进一步观察该重组病毒的免疫原性奠定了基础 。

猪乙脑病毒WHe株的PrM-E、NS1、E-NS2A基因的克隆及序列测定

本文通过RT_PCR扩增了猪乙型脑炎病毒WHe株主要抗原基因NS1(约 1.14kb)、prM_E(约 2 .1kb)、E_NS1_NS2A (约 3.0kb) ,并将NS1、E_NS1_NS2A、PrM_E基因克隆、测序。与Genbank发表的JEV基因序列进行序列分析 ,发现WHe株与其他 12种典型的JEV强毒株的同源性在 88.3%～ 99.4 %之间。WHe株与K94P0 5株的同源性最低 (88.3% ) ,与P3株的同源性最高 (99.4 % ) ,可认为WHe株是由P3株衍生而来的。在JEV基因组 5’端 389～ 3910的长 35 2 2nt的决定JEV抗原性的C_prM_E_NS1_NS2A区中 ,WHe株与P3株仅有 2 1个碱基不同 ,其中的 14个单碱基突变为同义突变 ,另外7个为错义突变 ,导致相应的氨基酸序列 (1173个 )中的 6个氨基酸发生了变异 ,其中的 5个氨基酸变异出现在含有各关键的抗体中和决定簇的E蛋白内 ,另一个位于NS1蛋白内。

我国D2-43株PrM-E基因的复制型载体质粒DNA的免疫原性研究

目的通过观察含我国登革2型病毒株D2-43的PrM-E基因的复制型SFV重组质粒DNA的免疫原性,为登革新型疫苗的研制提供依据。方法将PrM-E基因自T载体上切下,插入复制型SFV病毒载体质粒DNA中。将此重组质粒DNA以电穿孔法导入BHK21细胞,表达产物的特异性用间接免疫荧光法进行鉴定。采用去除内毒素的质粒提取试剂盒制备重组质粒DNA,然后以不同剂量通过肌肉注射途径免疫Balb/c鼠,鼠血清中的抗体用间接免疫荧光法进行检测。结果含PrM-E基因的重组SFV质粒DNA在BHK21细胞中可表达登革2型病毒的特异蛋白;经免疫Balb/c鼠后,鼠血清可与登革D2-43感染的C6/36抗原片起特异的抗原抗体反应。结论含登革2型病毒PrM-E基因的复制型SFV病毒载体质粒DNA在Balb/c鼠中可诱导登革2型病毒特异抗体的产生,但抗体水平较低。

我国D2-43病毒株PrM-E基因的复制型载体质粒DNA的免疫原性(英文)

观察含我国登革 2型病毒株 (D2 4 3)的PrM E基因的复制型SFV(semlikiforestvirus)重组质粒DNA的免疫原性 ,为登革新型疫苗的研制提供依据 .将PrM E基因自T载体上切下 ,插入复制型SFV病毒载体质粒DNA中 .将此重组质粒DNA以电穿孔法导入BHK2 1细胞 ,用间接免疫荧光法在感染细胞内可检测到登革 2型病毒特异蛋白的表达 .采用去除内毒素的质粒提取试剂盒制备重组质粒DNA ,然后以不同剂量通过肌肉多点注射途径免疫Balb c鼠 ,获得的鼠血清可与登革D2 4 3感染的C6 36抗原片起特异的抗原抗体反应 .结果表明 ,含登革 2型病毒PrM E基因的复制型SFV病毒载体质粒DNA在Balb c鼠中可诱导登革 2型病毒特异抗体的产生 ,但抗体水平较低 .

蜱传脑炎病毒prM-E蛋白的真核表达及其在荧光素酶免疫共沉淀技术中的应用？

为了探索一种新型的血清学技术的荧光素酶免疫共沉淀技术（LIPS），本研究利用真核表达系统制备了蜱传脑炎病毒结构蛋白prM-E与荧光素酶融合蛋白，并评价了其在LIPS系统中的检测效果。首先以蜱传脑炎病毒RNA为模板，采用RT-PCR技术扩增prM-E抗原基因，连接到pNLF1-secN质粒上构建真核表达载体pNLF-prM-E，使prM-E蛋白与荧光素酶串联融合表达，并将该质粒转染到Cos7细胞中。结果显示，转染重组质粒pNLF-prM-E的细胞上清中可检测到荧光素酶的高表达；进而用间接免疫荧光试验（ IFA）检测到转染的细胞与蜱传脑炎病毒抗体特异性结合；在此基础上，用LIPS方法对蜱传脑炎病毒感染患者血清进行检测，从20份患者血清中检出19份阳性，7份对照血清均为阴性。结果表明该重组抗原具有良好的特异性和灵敏性，可以用于LIPS系统中的候选检测抗原。

登革3型病毒prM-E基因重组质粒DNA的构建和真核表达

构建登革 3型病毒 prM E基因的真核表达重组质粒 ,并进行体外表达 ,为登革DNA疫苗的研究奠定基础。用RT -PCR法获得 prM -E基因片段 ,然后将其克隆到真核表达载体中。用电穿孔法将重组质粒DNA转入BHK细胞 ,通过免疫荧光法检测外源基因在真核细胞中的表达。结果 ,通过酶切和序列测定证实了构建的重组质粒DNA含序列正确的 prM- E基因。用免疫荧光法检测到转染了重组质粒DNA的BHK细胞的胞浆中有登革 3型病毒特异蛋白的表达。说明含有登革 3型病毒prM -E基因的真核表达重组质粒可以在BHK细胞中表达 ,该结果为观察该重组质粒的免疫原性奠定了基础。

猪流行性乙型脑炎病毒prM-E抗原捕获ELISA检测方法的建立

为建立猪流行性乙型脑炎病毒(JEV)的检测方法,本研究以pr M-E结构蛋白特异性单克隆抗体(MAb)5B10和5E7分别作为捕获抗体和辣根过氧化酶标记的检测抗体,对反应条件进行优化,建立了抗原捕获ELISA(AC-ELISA)方法。该方法与其它常见猪病病原无交叉反应,特异性强。该方法可以检出1.25×105 pfu/m L的病毒和48.44 ng/m L pr M-E重组蛋白,最佳线性检测范围为0.05μg/m L^1.00μg/m L,线性相关系数(R2)为0.996。组装的试剂盒批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%,具有良好的重复性。试剂盒4℃保存12个月稳定。该研究为JEV亚单位疫苗的研制与生产提供了技术支持。

寨卡病毒包膜prM-E蛋白的结构和功能分析

包膜蛋白prM-E是黄病毒的主要结构蛋白,含有许多病毒的表面抗原,与病毒的致病力和宿主嗜性有关,但目前对寨卡病毒的prM-E蛋白研究很少,作者利用生物信息学方法对寨卡病毒的E蛋白进行了预测,重点阐述了prM-E蛋白在黄病毒形成病毒样颗粒过程中的应用,并对寨卡病毒病毒样颗粒的应用进行了展望。

猪乙型脑炎PrM-E重组腺病毒的构建及免疫原性

应用RT-PCR方法扩增出猪乙型脑炎病毒的PrM-E基因,经序列测定正确后,通过SalⅠ和EcoRⅠ酶切位点把该基因插入经过同样双酶切的穿梭质粒pDC315中,获得重组穿梭质粒pDC315-PrM-E。重组穿梭载体经过酶切和PCR鉴定后进行测序,证明所插入的基因是正确的。将获得的重组穿梭质粒与腺病毒骨架质粒pBHGlox-E1.3Cre共转化293细胞获得重组腺病毒Ad-PrM-E。经PCR鉴定证明所构建的重组腺病毒含有PrME基因。小白鼠免疫28 d后进行间接ELISA检测证明所构建的重组腺病毒在小白鼠体内能够诱导产生抗JEV的抗体,阳转率90%。

猪乙型脑炎病毒的PrM-E基因克隆与测序

通过RT-PCR扩增乙型脑炎病毒主要抗原基因PrM-E,并将PrM-E基因克隆及测序后,与GenBank发表的SA14-14(M18370)基因序列进行比较分析,发现试验毒株与乙型脑炎病毒SA14-14毒株的同源性为98%。在乙型脑炎病毒基因组决定乙型脑炎病毒抗原性的PrM-E的2 000 bp序列中,试验毒株与SA14-14株有35个碱基不同,但却不影响它的功能。

表达乙型脑炎病毒PrM-E基因慢病毒载体的构建

利用RT-PCR方法扩增获得了乙型脑炎病毒PrM-E基因,并将之克隆至慢病毒载体系统中的转移质粒pHR-IRES-EGFP中,得到重组质粒pHR-PrM-E。将该质粒与包装质粒pCMV△8.2、囊膜质粒pVSV/G共转染293FT细胞,培养48h后收集细胞上清,并将之转导293FT细胞。通过报告基因EGFP表达、间接免疫荧光和Western-blot检测,结果表明,上述三质粒共转染293FT细胞后,获得了假病毒,并且该假病毒可以高效转导正常293FT细胞。同时,PrM-E基因可以在被转导细胞中正确表达,从而为研制基于慢病毒载体的乙型脑炎病毒新型疫苗奠定了基础。

我国登革2型病毒43株PrM-E基因的DNA免疫原性研究

目的 观察我国登革 2型病毒 43株PrM E基因的DNA免疫原性及非甲基化细菌性CpG对DNA免疫效果的影响。方法 采用RT PCR和分子克隆技术构建PrM E基因片段 ,并将其插入真核表达载体pBK CMV中。在证明其可在哺乳动物细胞中高效表达的基础上 ,进一步用重组质粒DNA免疫小鼠。通过间接免疫荧光法对采集的鼠血清中的病毒特异抗体进行检测。结果 用含PrM E基因的重组质粒DNA免疫小鼠可诱导产生登革 2型病毒特异的抗体 ,且产生的抗体在小鼠体内可持续 3周以上。用含CpG的pUC19质粒和重组质粒的共免疫与单独免疫重组质粒所诱导的抗体水平没有显著差别。结论 我国登革 2型病毒PrM E基因重组质粒DNA具有一定的免疫原性。在本实验条件下 ,含非甲基化细菌性CpG的pUC19质粒DNA ,对PrM E基因的DNA免疫效果没有促进作用。

我国登革2型病毒43株PrM-E基因的构建及其在哺乳动物细胞中的表达

目的：构建我国登革２ 型病毒４３ 株（Ｄ２－４３）的ＰｒＭ－Ｅ基因片段，观察其在哺乳动物细胞中的表达。方法：采用ＲＴ－ＰＣＲ和分子克隆技术构建ＰｒＭ－Ｅ基因片段，包括编码ＰｒＭ 的信号肽序列、完整的ＰｒＭ 蛋白和去除羧基端跨膜疏水区部分氨基酸的９７．８％ Ｅ蛋白的基因片段。用电穿孔法将构建的含有ＰｒＭ－Ｅ基因的ｐＣＭＶ－ＭＥ真核重组质粒导入哺乳动物细胞中进行表达。采用蛋白印迹和间接免疫荧光法对表达产物进行特异性鉴定。结果与结论：构建的ＰｒＭ－Ｅ基因全长２ ０１９个核苷酸，序列分析证明其核苷酸序列是正确的。ＰｒＭ－Ｅ基因在ＢＨＫ－２１ 细胞中获得高效表达，表达蛋白可与Ｄ２－４３ 多克隆抗体起特异反应，且表达蛋白主要位于细胞浆中。

森林脑炎病毒prM-E蛋白在昆虫细胞中的表达及免疫活性测定

目的为了表达森林脑炎病毒prME蛋白,为森林脑炎快速诊断试剂的研制奠定基础。方法经过RTPCR扩增、重组转移载体构建、细菌内转座和昆虫细胞转染,以杆状病毒昆虫细胞表达系统成功地表达了森林脑炎病毒MDJ01株prME蛋白。结果从感染细胞上清中电镜观察到重组蛋白形成的球型颗粒,说明重组病毒感染细胞后产生病毒样表达颗粒(viruslikeparticlesVLPs),并且分泌至细胞外。免疫印迹试验和间接免疫荧光试验表明,表达的重组蛋白能够与抗森林脑炎病毒抗体特异结合,具有良好的抗原性。ELISA和间接免疫荧光染色证实,重组prME蛋白可以作为抗原用于检测患者血清特异性抗体。结论在昆虫细胞中表达的prME具有良好的抗原性,本研究为森林脑炎快速特异诊断试剂研制奠定了基础。

我国登革2型病毒prM-E基因与SFV病毒载体重组RNA的构建

目的 :构建我国登革 2型病毒 4 3株prM E基因的甲病毒 (Semlikiforestvirus ,SFV)重组RNA ,为登革新型疫苗的研究奠定基础。方法 :首先将含有多种稀有限制酶位点的接头插入pSFV载体的多克隆位点 ,再把prM E基因克隆至该载体中。将获得的重组质粒DNA经体外转录后 ,通过电穿孔法将其转录的RNA产物导入宿主细胞 ,并采用间接免疫荧光法检测prM E基因的表达。结果 :已获得含多种酶位点的pSFV病毒载体 ,并且所构建的含prM E基因的重组pSFV病毒RNA ,在宿主细胞中的表达产物可与登革 2型病毒特异抗体起反应。结论 :构建的含prM E基因的重组pSFV病毒RNA可表达我国登革 2型病毒株的特异蛋白。

登革3型病毒prM-E和NS1多基因重组质粒DNA免疫原性增强效果观察

目的 观察登革 3型病毒的prM E和NS1基因重组质粒DNA混合免疫对免疫原性的增强作用 ,为登革DNA疫苗混合免疫提供实验依据。方法 将登革 3型病毒的prM E和NS1基因重组质粒DNA分别混合及单独免疫BALB/c小鼠 ,采用中和试验及MTT法检测免疫小鼠血清中和抗体及脾细胞特异性CTL(cytotoxicT lymphocytes)杀伤率。结果 混合重组质粒DNA免疫组与单一prM E基因重组质粒DNA免疫组均在末次免疫后第 14天检测到中和抗体 ,在第 33天达到高峰 ,为 1∶32。在末次免疫后第 4 1天 ,当效靶比为 4 0∶1时 ,混合重组质粒DNA免疫组的特异性CTL杀伤率为 15 % ,而 2个单质粒DNA组分别为 10 .9%和 12 .4 %。结论 重组质粒DNA混合免疫可同时诱发小鼠产生体液免疫和细胞免疫 ,而且细胞免疫应答具有一定的增强作用 ,但没有出现特异性CTL杀伤率的协同增强效果。

我国登革2/4型病毒株Pr-M-E基因的双表达质粒构建及在真核细胞中的共表达

将我国登革 2、4型病毒分离株PrM E基因通过RT PCR以病毒RNA为模板扩增我国登革 2型 4 3株和 4型B5株的PrM E基因 .并分别克隆至pGEM TEasy载体 ,然后亚克隆至双顺反子表达质粒的两个多克隆位点 ,获得同时含有登革 2型 4 3株和 4型B5株PrM E基因的双顺反子重组表达质粒pIDME2 4 .在用该重组质粒转染的BHK2 1细胞中 ,不但可检测到PrM E基因的转录产物 ,而且采用间接免疫荧光法还可观察到针对登革 2型 4型病毒的特异荧光 .研究结果表明 ,重组的双顺反子表达质粒在真核细胞中可共表达登革两个血清型PrM E基因 。

乙型脑炎病毒XJ/08/01株的分离鉴定及PrM/E基因的遗传进化分析

从新疆维吾尔自治区石河子地区某猪场采集了150份猪脑组织样品,利用RT-PCR方法进行流行性乙型脑炎病毒(JEV)NS1基因扩增,结果有32份组织样品扩增出了430 bp的特异性目的条带。用检测的阳性样品研磨液接种乳鼠进行JEV的分离,经3次乳鼠传代后获得了1株JEV,命名为XJ/08/01。在此基础上,设计引物从接毒乳鼠脑组织样品中扩增JEV的主要抗原基因PrM/E并进行序列分析,结果表明,该分离毒株与JEV疫苗株SA14-14-2的同源性为99.6%,根据基因分型法确定该分离株属于基因Ⅲ型JEV。

乙脑病毒prM/E基因重组伪狂犬病病毒的构建

以乙型脑炎病毒 SA1 4 - 1 4 - 2株基因组 RNA为模板 ,采用RT- PCR一步法扩增 pr M/ E基因的全长 c DNA(约 2 kb) ,将其克隆至 p MD1 8- T载体 ,获得了克隆质粒 p Tpr M/ E,并对其进行了测序。序列分析结果表明 ,与已报道的 SA1 4 强毒株和 SA1 4 - 1 4 - 2疫苗株的核苷酸比较 ,pr M基因的序列同源性为 1 0 0 %,E发生了 4个点突变 ,其中 1个为回复突变 ,并导致了 3个氨基酸的改变。以伪狂犬病病毒 Ea株 TK- / g G- / L ac Z+突变株为载体 ,构建了 1株乙脑病毒 pr M/ E基因的重组伪狂犬病病毒 TK- / g G- / pr M/ E+。乙脑病毒 pr M/ E基因的克隆及重组伪狂犬病病毒的成功构建 ,为开展乙脑病毒分子生物学及猪猪伪狂犬病一乙脑二价基因工程疫苗的研究打下了坚实基础。

深圳市一起输入性登革热疫情的分子流行病学研究

目的对2007年深圳市报告的一起输入性疑似登革热病例查明病因。分离鉴定病原体,从分子水平分析分离株的生物学特征。方法对疑似患者血清标本采用ELISA、胶体金免疫层析法和实时荧光定量PCR方法分别检测登革病毒IgM、IgG抗体和病毒核酸,并用C6/36细胞分离登革病毒。采用RT-PCR方法扩增病毒PrM/M-E基因后进行序列测定,并与不同国家和地区的登革毒株进行同源性比较和进化树分析。结果从患者血清标本中检测到登革病毒IgM、IgG抗体和登革3型病毒核酸,并首次成功分离到登革3病毒,将其命名为DEN3-SZ0739。深圳市登革3型病毒分离株SZ0739与登革3型国际标准株H87株、国内外流行株80-2、GWL-25株在PrM/M-E基因上核苷酸同源性分别为94.1%、93.9%、96.9%,而与登革1、2、4型国际标准株HAWAII、NGC、H241同源性分别为66.1%、59.1%、58.2%。进化树显示SZ0739株与2007年新加坡分离株SGEHI(D3)0235Y07亲缘关系最近,在进化树的同一分支上,和1 416株(India 1984)、1 326株(Sri Lanka1981)、1 696株(Samoa 1986)等同属基因Ⅲ亚型。结论从病原学、血清学和分子生物学特征上均证实该输入病例是由登革3型病毒引起,该毒株最有可能来源于新加坡。