拟南芥miR395d基因的克隆和过表达载体构建及其在油菜中的转化

MicroRNAs(miRNAs)是一类内源性长度约为21～24个核苷酸,在基因表达、生长发育、细胞周期及环境胁迫等方面起着重要作用的单链非编码小分子RNA。研究表明:植物miRNAs通过转录后以切割的方式对其靶基因的表达起着负调控作用。miR395的靶基因分别为ATP硫酸化酶和硫转运体SULTR2;1,两者在硫同化及转运中起着重要的作用。为了进一步探究miR395的功能,本研究利用PCR法从拟南芥中克隆了miR395d前体基因,并与pCAMBIA1304载体连接,构建了miR395d前体基因的过量表达载体,通过根癌农杆菌介导法将其转化到甘蓝型油菜特选4号中,目前已获得了转基因植株。

水稻miR395d基因过表达载体的构建及功能初步分析

为研究miR395调控水稻硫吸收和同化的分子机制,我们通过生物信息学的分析方法,设计了水稻mi R395d基因的前体序列,将其连接到pHB载体上,从而构建了miR395d的过表达载体,随后通过农杆菌介导法转化水稻品种日本晴,获得10组转基因株系。采用潮霉素抗性筛选鉴定阳性转基因植株,在潮霉素溶液中能正常生长的为阳性植株,反之则为假阳性植株,并利用qRT-PCR的方法验证miR395d的表达量。结果表明,阳性转基因株系OE-2、OE-3和OE-4中miR395d基因表达量显著升高,说明miR395d的过表达载体构建成功。初步分析miR395d过表达植株的功能发现,在缺硫的水平下,与日本晴相比,miR395d过表达水稻植株叶片出现萎黄、植物生物量显著降低、根长显著变短等表型,其生长发育受到抑制。由于硫是植物生长所需营养元素之一,对植物生长发育及作物产量和品质均存在重要影响。miR395d过表达水稻株系的构建,为后续进一步研究miR395在水稻硫吸收和同化路径中的作用提供了材料。

野生蕉miR395a前体克隆与进化特性及启动子分析

植物miR395参与硫代谢调控,并在应答逆境胁迫等方面起重要调控作用.为了解香蕉miR395的分子特性和进化规律,在参考香蕉基因组信息的基础上,结合RT-PCR技术,从三明野生蕉（Musa itinerans）叶片中获得81 nt miR395a前体序列,包含21 nt miR395a成熟体序列.进化特性分析表明,植物miR395a前体存在于27个物种中,野生蕉pre-miR395a序列与双子叶耧斗菜（Aquilegia viridiflora Pall.）最为接近,与单子叶的水稻、玉米、高粱最远,表明野生蕉pre-miR395a的起源比较特殊;前体序列长度差异较大（57-226 nt）;miR395a成熟体序列分析发现,来自5p臂上的miR395a序列特异性较大.野生蕉miR395a前体能形成典型的发卡结构,miR395a成熟体位于前体的3p臂上.转录起始位点分析表明,野生蕉pri-miR395a转录起始区域位于-87 bp--38 bp,A为转录起始位点.启动子顺式作用元件预测分析表明,野生蕉miR395a启动子包含多个激素、胁迫、生物钟及光响应元件,可能与响应胁迫密切相关.qPCR检测结果也发现miR395a的表达量在低温胁迫下极显著下调,表明响应低温胁迫.综上表明三明野生蕉在响应低温胁迫过程中miR395a起着重要调控作用,这对于进一步研究野生蕉miR395a在低温胁迫中的作用机制具有参考价值.