乙型肝炎病毒表面抗原preS2+S基因在Pichia Pastoris酵母系统的分泌表达

拟获得adw2亚型乙型肝炎(乙肝)病毒表面抗原preS2+S基因在PichiaPastoris酵母分泌型表达系统(pPIC9K)的高效表达。实验首先将adw2亚型乙肝病毒表面抗原preS2+S基因重组到分泌型酵母表达载体(pPIC9K)形成表达质粒,电转化酵母细胞KM71,G418筛选多拷贝整合克隆,经甲醇诱导表达并用SDS-PAGE电泳及酶免疫法检测表达产物。经100个克隆筛选获得了表达量较高的表达菌株WC4。该菌株甲醇诱导后细胞上清10倍浓缩SDS-PAGE电泳检测显示,细胞上清中有特异蛋白条带,且第6天表达量最高,表达产物单体分子量为31kD左右。用美国雅培公司AUZYMEMONOCLONAL试剂盒估算表达量为2μg/100OD600细胞。上述结果表明,乙肝病毒表面抗原preS2+S基因在本系统中获得了分泌表达。同时检测了酵母细胞裂解液中特异蛋白质的表达,结果发现,自甲醇诱导后第一天即可检测到表达产物,而且除了第6天细胞外表达量高于细胞内外,其余各天的表达水平均表现为细胞内高于细胞外。以上结果提示,利用分泌型酵母表达系统表达乙肝病毒表面抗原在技术上可行,但表达产量偏低,一些蛋白滞留在细胞内未能分泌到培养基中。

HBV PreS2S/Fc融合基因真核表达载体的构建及表达

目的:构建含HBV PreS2S和Fc融合基因的真核表达载体pcDNA3 S2S/Fc并在真核细胞中进行表达. 方法:应用重叠延伸剪切技术(splicing by overlapping extension,简称SOE)经两次PCR获得嵌合基因片段S2S/ Fc,回收后克隆到pGEM-T Easy TA克隆载体,获得合适的酶切位点,再采用双粘端连接法转克隆入真核表达载体pcDNA3中,得到真核重组载体pcDNA3 S2S/Fc.然后用脂质体法转染SP2/0细胞. 结果:对重组载体进行了限制性酶切鉴定及测序分析,汪明连接正确;经间接免疫荧光捡测证实该重组载体能在真核细胞中表达插入的外源性基因编码的融合蛋白. 结论:真核表达载体pcDNA3 S2S/Fc的成功构建及在SP2/0 细胞中的有效表达,为进一步探讨HBV感染的特异性免疫治疗提供了实验依据.

HBV PreS2+S/IFN-α融合基因真核表达载体的构建及其表达

构建含HBVPrdS2 +S和IFN α融合基因的真核表达载体pcDNA3.1.S2S/IFN α并在真核细胞中进行表达。应用重叠延伸剪切技术 (splicingbyoverlappingextension ,简称SOE)经两次PCR获得嵌合基因片段S2S/IFN α ,回收后直接克隆到 pcDNA3.1V5 /HisTOPOTA克隆载体 ,得到真核重组载体pcDNA3.1.S2S/IFN α。然后用脂质体法转染VeroE6细胞。对重组载体进行了限制性酶切及PCR鉴定 ,证明连接正确 ;经间接免疫荧光检测证实该重组载体能在真核细胞中表达插入的外源性基因编码的融合蛋白。真核表达载体pcDNA3.1.S2S/IFN α的成功构建及在VeroE6细胞中的有效表达 。

T载体克隆乙肝病毒preS2+S基因的实验研究

将商品化真核表达载体pcDNA3改造成T载体pcDNA3－T，并运用pcDNA3－T直接克隆了由PCR扩增的adw2亚型乙肝病毒preS2与S基因。结果：pcDNA3－T与PCR产物的重组率高达70％。提示：该方法具有简便，省时等特点。