基于单核细胞增生李斯特菌prfA基因新型原核温控表达载体的构建

单核细胞增生李斯特菌的prfA基因编码一个温度控制启动蛋白,具有在37℃条件下启动下游基因表达的功能。为构建新型原核温控诱导表达载体,本研究利用PCR方法扩增prfA基因,并将其与绿色荧光蛋白(GFP)或红色荧光蛋白(DsRed)基因分别插入到pET-28a和pUC19载体中,构建重组质粒pET-prfA-EGFP和pUC-prfA-DsRed。将重组质粒转化大肠杆菌DH5α,在37℃条件下培养,利用激光共聚焦显微镜观测细菌中荧光蛋白的表达情况。结果表明,构建的两种重组质粒的荧光蛋白基因于37℃条件下,在受体菌中均获得有效表达,而30℃时则仅有微弱的本底荧光蛋白表达。本研究构建了以最适生理温度为单一诱导条件的温控表达的新型原核细胞表达载体,为蛋白的表达与功能研究提供了新的平台。

单核细胞增生李斯特菌prfA基因重组菌的构建及其生物学特性研究

为制备单核细胞增生李斯特菌(LM)减毒的prfA基因重组菌,本研究通过构建重组质粒pKSV7-ΔprfA-gfp,电转化至LM TA感受态细胞中,将绿色荧光蛋白基因gfp插入LM的prfA基因第25 bp～93 bp之间,在42℃和10μg/mL氯霉素的双重选择压力下,筛选LM重组菌(rLM-ΔprfA-gfp),并对其生物学特性进行鉴定。试验结果表明,重组菌与亲本菌相比具有相似的体外生长特性,溶血素基因(hly)mRNA的转录水平降低;对小鼠的毒力显著减弱,其LD50由105.53升高到109.79,对肝、脾、肾的损伤不明显;免疫保护力试验显示重组菌与LM TA灭活疫苗的保护率分别为90%和35%,表明rLM-ΔprfA-gfp比传统疫苗具有更高的保护力。本研究构建的rLM-ΔprfA-gfp具有良好的遗传稳定性,并且具有较好的免疫原性,为LM活疫苗载体和分子标记疫苗的研制奠定了基础。

单核细胞增生李斯特菌野毒株prfA基因的克隆及其分子特征分析

利用PCR技术对单核细胞增生李斯特菌(LM)TA野毒株prfA基因进行扩增,将其克隆后测序,并对该分离株prfA基因及其编码蛋白进行分子特征和遗传变异分析。结果显示,TA株prfA基因全长为714bp,编码237个氨基酸。通过对推导的prfA蛋白氨基酸序列结构域分析发现,该蛋白从N端到C端分别包括1个β-环结构域(18～97aa)、1个α-螺旋构成的C区(110～136aa)、1个α-螺旋构成的D区(136～155aa)、1个由螺旋-转角-螺旋构成的HTH结构域(170～196aa)和1个由α-螺旋构成的亮氨酸拉链G区结构域(211～237aa)。通过对GenBank中登录的35株分离株prfA基因遗传变异分析发现,不同地域分离株的prfA基因在核苷酸水平以点突变为主;TA株第197位氨基酸由赖氨酸(Lys,K)突变为天冬氨酸(Asn,N)。

多杀性巴氏杆菌prfA基因的序列分析与原核表达

为探索多杀性巴氏杆菌的致病机理，采用PCR方法分别扩增了家兔源和禽源多杀性巴氏杆菌C51—17、Pm898、Pm8916、Pm901、Pr09616、PmZM、PmQin菌株的prfA基因，并对其进行序列分析。将C51—17株的prfA基因克隆到质粒pET30a中，将重组表达载体pET30a—prfA转化到大肠杆菌BL21（DE3）pLysS感受态细胞中，经IPTG诱导表达，进行SDS—PAGE分析和Western—blot分析。结果显示，这7株菌株与GenBank登录的3株多杀性巴氏杆菌之间prfA基因在核苷酸水平上的同源性为95．6％～100％，在氨基酸水平上的同源性为98．9％～100％。诱导表达的重组蛋白PrfA的分子质量约为45．6ku，与预期的大小一致，以可溶性形式表达。重组蛋白PrfA可与家兔抗多杀性巴氏杆菌阳性血清反应，具有良好的反应原性。

单核细胞增生性李斯特菌prfA基因缺失株的构建及其生物学特性

【目的】单核细胞增生性李斯特菌(Lm)是人兽共患李斯特菌病的病原菌,其致病性与调控因子PrfA蛋白作用下毒力基因的表达有着密切关系,本文初步探讨了PrfA蛋白对细菌毒力因子的调控作用。【方法】利用同源重组技术对血清型分别为1/2a和4b的LM4、F4636进行prfA基因的敲除,并构建其回复突变株,对获得的突变株LM4ΔprfA、F4636ΔprfA进行生物学特性研究。【结果】实验结果表明:两株缺失株的溶血活性丧失、回复突变株的溶血活性得到恢复,突变株还丧失磷脂酶活性,黏附和侵袭特性显著下降(P<0.05),对BALB/c小鼠的半数致死剂量提高了105个数量级。【结论】由此表明,PrfA蛋白对hly、plcB、inl家族基因的表达及细菌毒力具有重要的调控作用。prfA基因缺失株的构建为进一步研究PrfA蛋白的调控功能提供了材料,为研究其在Lm致病性中的作用奠定了基础。

单核细胞增多性李斯特菌LIPI-1全基因克隆与序列分析

参考GenBank中单核细胞增多性李斯特菌(LM)第I毒力岛(LIPI-1)有关基因序列设计引物,分段扩增、克隆了分离菌株XFL0605LIPI-1毒力岛全基因序列,序列全长8 558 bp,包括完整的prfA、plcA、hly、mpl、actA和plcB6个基因。对LIPI-1编码的6个毒力基因进行序列分析,各毒力基因反映的进化关系不尽一致,表明李斯特菌株在获得外源性毒力基因方面具有不同步性,各毒力基因来源也不尽相同。应用相应软件对各毒力基因编码蛋白的信号肽、跨膜区进行预测,确定了基因序列中调控蛋白PrfA结合区核苷酸序列。分析并确认了hlyA基因及推导氨基酸序列PEST基序和C端保守11肽序列。研究还发现LM菌株XFL0605actA基因编码604个氨基酸,缺失了105 bp富脯氨酸重复片段编码碱基,只有2个E/DFPPPPXD/E重复序列。

食品中单核细胞增生李斯特菌株的分离及聚合酶链式反应鉴定

目的建立单核细胞增生李斯特菌的聚合酶链式反应(PCR)检测方法,了解市售食品中单核细胞增生李斯特菌的污染情况。方法采集成都市市售生畜肉、生禽肉、熟肉制品、水产品、生食蔬菜以及其他熟食等食品样品共135份,采用李氏增菌肉汤(LB1,LB2)进行初增菌,应用选择性分离培养基PALCAM和在TSA-YE平板上进行分离,利用单增李斯特显色平板进行鉴定;根据李斯特菌的特异性基因iap基因设计引物,采用PCR方法检测所有分离的李斯特菌株;根据单增李斯特菌的特异性基因hly基因和prfA基因设计引物检测单核细胞增生李斯特菌株。结果 135份样品中共检出李斯特菌17株,检出率为12.6%;其中单核细胞增生李斯特菌4株,检出率为3.0%。结论本研究建立的PCR方法具有特异性,本市市售食品不同程度受到李斯特菌的污染。