牛结核病荧光定量PCR引物探针的组合筛选比较

为比较牛结核病荧光定量PCR(qPCR)不同引物探针组合的特异性和敏感性,验证其临床检测效果,选取国际、国家、行业、地方标准及文献报道的11组qPCR鉴定引物探针组合,采用牛分枝杆菌基因组DNA国家二级标准物质、参考菌株核酸和临床奶样对其进行比较、验证。结果显示:11组引物探针均无非特异性扩增,表现出良好的特异性;国标IS1081引物检测灵敏度最高,最低检测限可达1.4×10^(-1);除国标Mtb(结核分枝杆菌)引物外,其他引物探针组合重复性良好(CV<10%);30份临床样品中国标IS1081引物阳性样品检出率明显高于其他引物。结果表明,国标IS1081引物探针组合特异、灵敏、临床检测效果更优,推荐用于实验室qPCR检测牛结核病。

基于酶介导双重指数扩增技术(EmDEA)的小火蚁快速检测方法的开发

小火蚁Wasmannia auropunctata是危害性最严重的入侵蚂蚁之一,对动植物、生态、经济甚至是人类都容易造成严重影响,是我国的重大检疫害虫之一。本研究为实现小火蚁的现场快速精准检测,通过自研程序筛选出小火蚁全基因组中的特异性片段,具有更高的特异性,基于酶介导双重指数扩增技术(EmDEA)筛选了适用的引物、RNA探针,全部反应所需时间小于20 min,并验证了其特异性和灵敏度。结果显示这种方法可在短时间内达到极高检测灵敏度与特异性,最低检出限约为4 ng。这种方法极大程度降低对设备的依赖,简单、快速、特异,为小火蚁的基层检测与现场诊断提供技术支持。

非洲猪瘟病毒微滴式数字PCR检测用引物和探针的筛选

本试验针对非洲猪瘟病毒基因保守序列设计了四对引物和探针用于微滴式数字PCR检测,经过数字PCR梯度反应体系及条件优化、特异性试验、灵敏度和线性范围试验,最终确认了一对引物和探针结果较为理想,其中引物浓度为900 nmol/L,探针浓度450 nmol/L,最适退火温度为54.2℃。

靶向鉴别、检测动物双歧杆菌的引物探针及应用

为解决目前应用于鉴别动物双歧杆菌的方法的用时长、操作复杂、实验环境低适配性等缺点,开发了一种基于ERIC-PCR技术设计特异性引物探针以靶向鉴别、检测动物双歧杆菌的方法。以动物双歧杆菌HP-B1124基因组DNA为基础,优化动物双歧杆菌HP-B1124的ERIC-PCR反应条件,对ERIC-PCR片段逐一回收并进行测序,针对测序结果设计两对特异性引物探针,对两对引物探针设计结果的准确性、特异性、可检测基因组DNA的含量限度、普适性进行检验,并运用所设计的两对特异性引物探针检验市售公示配方中含有动物双歧杆菌的产品。本研究设计的两对特异性引物探针可简单、快速、靶向的用于动物双歧杆菌的鉴定。此方法优化了目前相对传统的动物双歧杆菌纯培养及平板计数鉴定方法,一定程度上解决了SNP基因分型技术及实时荧光定量PCR法等方法在鉴定动物双歧杆菌方面对实验设备及试剂的高要求,具有成本低、特异性强的特点,有较为广阔的市场开发前景。

特异性检测干酪乳杆菌的引物探针设计

目的:基于肠杆菌科基因间重复共有序列聚合酶链反应(Enterobacterialrepetitive Intergenic Consensus PCR,ERIC-PCR)技术,设计特异性引物探针,实现干酪乳杆菌的靶向检测。方法:以干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)HP-B1142为研究对象,通过不同实验,优化干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)的ERICPCR反应体系。通过凝胶电泳获得特定的条带,对其进行测序和分析,设计出特异性的引物探针,达到对干酪乳杆菌靶向鉴别的目的。结果:通过不同实验,得到干酪乳杆菌的最佳ERIC-PCR反应体系;基于干酪乳杆菌ERIC基因片段,获得两对特异性引物,可在多种DNA的混合溶液中快速靶向鉴别出干酪乳杆菌。结论:基于ERIC-PCR技术获得的特异性引物探针,可高效、灵敏地实现复杂生境中干酪乳杆菌检出。

一种副干酪乳杆菌快速鉴定方法的建立及应用

目的:基于肠杆菌基因间重复一致序列聚合酶链反应技术(Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus-Polymerase Chain Reaction,ERIC-PCR),寻找并制备一对引物探针,灵敏、准确地从复杂生境中鉴定副干酪乳杆菌。方法:寻找副干酪乳杆菌HP-B1145的肠杆菌基因间重复一致序列(Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus,ERIC)最佳反应体系,对ERIC片段回收纯化得到特定条带及序列结果,据此设计引物,快速鉴定副干酪乳杆菌。结果:根据回收得到的副干酪乳杆菌HP-B1145 ERIC片段,设计出了一对引物探针(1145-S-F:5’-GCAGGATGCTGATTGTTAGCAG-3’;1145-S-R:5’-CTCCGACCAAAGCGACTATGAC-3’)。结论:根据引物特异性、准确性、普适性、含量限度实验得出,设计的引物能准确灵敏地从复杂生境中鉴定副干酪乳杆菌。

松材线虫实时PCR检测技术

根据松材线虫核糖体DNA内部转录区设计了一对特异引物F11/R11与探针TaqMan-11,构成松材线虫实时PCR检测方法。采用该检测方法对分离自枯死松树体内的松材线虫、拟松材线虫、大核滑刃线虫、霍夫曼尼伞滑刃线虫和长尾属线虫进行检测。结果显示,所有松材线虫株系都能够检测到荧光信号,而拟松材线虫、大核滑刃线虫、霍夫曼尼伞滑刃线虫、长尾属线虫以及对照均没有检测到荧光信号。表明探针Taq-Man-11与引物组合对松材线虫具有很强的特异性。此外,利用检测方法,在10μL的反应体系中,最少可以检测到0.005pg的松材线虫DNA含量。实时PCR也可以成功地检测出单条松材线虫。

PCR和随机引物标记探针的方法比较

采用PCR标记法和随机引物标记法对小白鼠、欧洲田鼠(M icrotus arvalis和Pitymys duodecim costatus)的Sry基因保守区进行地高辛标记,结果显示PCR标记的探针灵敏度要高于随机引物法,同时对两种标记方法进行了比较,为进一步进行Southern杂交研究打下了基础。

基于TaqMan实时荧光PCR检测肉制品中羊源性成分

随着动物源性产品(农产品、食品和饲料)中掺假造假事件不断增多以及动物来源性疾病的传播风险逐渐加大,作为保障食品安全和维护消费者权益的高效检测手段,动物源性成分的定性和定量检测技术已成为国内外的研究热点。本研究通过比对分析8种动物的线粒体全基因组序列筛选出羊源性成分特异性的引物和探针组合进行基于实时荧光PCR技术的羊源性成分鉴定。结果表明,所研发的羊源性成分检测的引物和探针具有高度的特异性,同时具有较好的灵敏度(可检测到1 pg的DNA)。羊肉制品中羊源性定量检测试验结果说明,此方法具有较好的定量检测能力。综上所述,以此引物和探针为基础的检测方法适用于羊源性食品和农畜产品的动物源性成分检测。

牛源性成分鉴定的引物和探针

为研发具有自主知识产权的锡林郭勒盟牛源性检测试剂盒。以8种动物的线粒体全基因组序列为基础,通过比对分析筛选出牛特异的引物和探针组合进行荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)。以所设计的引物和探针为基础的牛源性成分检测具有高度的特异性(仅对牛源性样品有典型扩增曲线,对其他动物来源的样品无扩增曲线)。检测灵敏度试验表明,利用此引物和探针的检测方法具有高度的灵敏度,可以检测到1 pg级的模板DNA。牛肉加工制品中牛源性定量检测试验表明,所研发的引物和探针具有较好的定量检测能力。以上研究结果表明此引物和探针组合适用于牛源性成分的定性和定量检测。

应用套入式聚合酶链反应(Nested-PCR)检测蓝舌病病毒的研究

本实验建立了一种Nested PCR方法。应用该方法检测 5株标准株蓝舌病病毒 (T4、T10、T11、T16、T2 0 )和 5株国内蓝舌病病毒分离株 (CF4、AF6、Z1、H1、G14) ,检测结果均为阳性 ,而检测相关环状病毒 (EHD2、EHD6、Ibraki) ,检测结果均为阴性。研究证明 ,此方法可检测到3 5fg的BTV—RNA ,灵敏度较高。该方法成功区分了蓝舌病病毒和相关环状病毒 ,比血清学方法更加优越 ,在临床检测方面具有广阔的应用前景。

黑麦通用特异性DNA探针的筛选

为了筛选出鉴定小麦背景下黑麦成分的通用特异性引物,选用胜利黑麦、八倍体小黑麦新麦73、六倍体小黑麦哈师209、普通小麦s165、中国春为试验材料,利用国内外发表的黑麦特异性DNA探针引物进行PCR扩增并进行了电泳检测。结果表明,在选用的6对引物(NOR-R1、AF1/AF4、PASW、pSC19.1、pSC20H、pSC10C)中只有4对引物即pSC20H、pSC119.1、AF1/AF4、NOR-1R在黑麦和小黑麦DNA中扩增出了特异性条带,扩增片段大小依次为1490、750、1500、300 bp左右,说明这4对引物是黑麦通用特异性DNA探针引物,可以用于在小麦背景下进行黑麦外源种质的鉴定。

实时荧光定量PCR对兔戊型肝炎病毒(HEV)的检测及评估

目的兔戊型肝炎病毒(HEV)是近年来新发现的,根据其分子生物学特征可能成为HEV的新基因型。为提高对兔HEV的检出率,本研究设计了针对兔HEV RNA的特异性引物和TaqMan探针并对其进行考评。方法 1)从GenBank中下载14条兔HEV全长序列,分别在其ORF1、ORF3片段的保守区域设计一条TaqMan探针和一对上、下游特异性引物,其中ORF1片段的探针及引物为C组,ORF3片段的为B组;A组的探针及引物为Jothikumar N等所报道的通用引物;2)制备相应的质粒标准品来构建定量标准曲线,并利用上述3套引物、探针对49份兔粪便及44份兔血液样品进行检测,将B、C组检测结果与A组的检测结果进行比较。结果新建立了两套兔HEV定量PCR的TaqMan探针及引物(B、C组),其标准曲线的斜率分别为-3.455和-3.469;使用上述3套引物及探针(A、B、C组)对49份粪便标本进行荧光定量PCR检测,其HEV RNA阳性率分别为67.35%(33/49)、67.35%(33/49)、57.14%(28/49),平均HEV RNA(log copies/g)拷贝数为6.18、5.90、6.11;44份血液标本的HEV RNA阳性检出率分别为65.90%(29/44)、56.82%(25/44)、50.00%(22/44),平均HEV RNA(log copies/mL)拷贝数为3.62、3.43、3.03;结果显示以上3组探针及引物均可用于粪便和血液标本的定量检测。结论兔HEV虽然有其独特的基因结构,但使用HEV通用引物检测不影响检出率。

检测施马伦贝格病毒核酸的荧光定量RT-PCR方法

根据施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus,SBV)S基因节段设计一对引物和TaqMan探针,建立了检测SBV核酸的荧光定量RT-PCR方法。通过优化反应体系和反应条件,该方法对101~107半数组织培养感染量(TCID50)的SBV核酸呈现良好的线性关系。利用德国FLI制备和保存的SBV核酸阳性(n=140)、SBV核酸阴性(n=132)和辛波血清群相关病毒核酸样品(n=16),对该方法的敏感性、特异性和重复性进行了验证。结果表明,所建立方法与FLI研制的SBV荧光定量RT-PCR具有相近的敏感性,两者对140份SBV核酸阳性样品的检测符合率达96.4%(135/140);可灵敏地检测出1TCID50的SBV RNA,并具有良好的重复性;除道格拉斯病毒(Douglas virus)外,与辛波血清群相关病毒核酸无交叉反应。用该方法对采自内蒙古呼和浩特市某养殖场的绵羊血清(n=47)和澳大利亚进口绵羊血清(n=47)的RNA进行了检测,结果未发现SBV核酸阳性样品。SBV荧光定量RTPCR检测方法的建立为应对施马伦贝格病提供了有效的检测手段。

多种探针的RT-PCR检测H5N1病原体方法的建立及应用

目的：建立与应用多种探针的 RT-PCR分析 H5N1病原体的检测方法体系。方法通过 GenBank发表的基因序列分析，针对保守区分别设计并合成2对特异性引物（P1/P2，P3/P4）。通过对扩增条件的优化，建立了检测两种病毒的快速双重PCR方法。结果合适引物浓度：P1/P2为0.32μmol/L，P3/P4为0.96μmol/L。双重检测的最小病毒核酸量为2 ng/μl，H5N1病原体混合液在相对应位置出现特异性条带，而其他病毒及空白对照均未出现条带。结论多种探针的RT-PCR分析对于 H5N1病原体检测方法在合理引物浓度的应用下具有很好的敏感度与特异度，值得在检验中推广应用。

基于高分辨率熔解分析的基因分型新技术

目的 综述基于高分辨熔解分析（HRM）的基因分型新技术.方法 介绍无标记探针、弹回引物、隐蔽探针、温度开关PCR、等位基因特异延伸PCR和低变性温度下共扩增PCR等技术的基本原理并评价其适用性.结果 这些新技术不仅避免了产物污染,提高了HRM基因分型的准确性和敏感度,而且拓展了HRM的应用范围.结论 基于HRM的基因分型新技术有望成为临床分子诊断的新方法.

一种适合中国地区HBV流行特征的荧光定量PCR检测方法的初探

目的设计1套适合中国地区HBV流行特征的高灵敏度、高特异性的HBV引物探针,建立HBV荧光定量检测的方法。方法在NCBI的Nucletide中输入HBV、China、complete genome等关键词找到中国地区的HBV序列,经比对后在保守序列设计引物探针,引物扩增的PCR产物经PMD-19载体连接制备成质粒标准品并测序验证序列,计算质粒拷贝数,将质粒标准品稀释成不同浓度的质粒标准品,用第三方标准品对质粒标准品做校正,绘制HBV标准曲线,并用Probit分析计算检测下限,验证灵敏度、特异性等。将所建立的HBV荧光定量检测方法检测100例标本,并与罗氏cobasTaq Screen MPX Test,version 2.0检测试剂盒检测结果做相关性分析。结果引物探针特异性好,质粒测序结果与目的产物完全吻合,质粒标准品曲线R^2>0.999,扩增效率为95.43%,线性范围(2×10~2-2.5×10~9)IU/m L,95%检测下限为16.2 IU/m L,批内重复变异系数为0.15%-1.11%,批间变异系数为0.91%-4.67%。与罗氏检测结果相关性高(R=0.96)。结论成功设计出1对适合中国HBV流行特征的引物探针,所建立的HBV荧光定量检测的方法灵敏度高、特异性好、重复性好,为在对中国地区开展血液HBV DNA载量检测及监控提供了技术支撑。

光学表面等离子共振生物传感器检测小麦转基因的研究

采用在镀金芯片上修饰一层带巯基的DNA探针引物,构建了一种简单、快速、灵敏的光学表面等离子共振DNA生物传感检测系统.通过监测转基因片段探针引物与目的片段结合时响应信号的变化获得被检物质的浓度,建立了转基因检测标准曲线.最低检测限达0.27 mg·L-1.

细菌16S rRNA基因实时荧光定量及分型方法的建立

目的细菌培养、组织学、免疫学及普通PCR方法等在病原菌的检测方面都存在一定的不足,不能满足临床的需要,探索快速可靠的败血症和化脓性脑膜炎等细菌性感染疾病诊断的新方法是目前亟待解决的关键问题。方法分析细菌16S rRNA基因序列,在高度保守区自行设计通用引物和探针,以及革兰阳性和阴性分型探针,对12种标准菌株、23种临床培养分离株、乙型肝炎病毒、新型隐球菌及白色念珠菌、人基因组DNA等进行了荧光定量检测,分析三种探针检测结果的相关性。结果细菌16S rRNA基因荧光定量PCR具有较好的敏感性和特异性,最低能检测到10个拷贝的16S rRNA基因,即相当于2个细菌,与病毒、真菌及人基因组DNA等无交叉阳性反应;12种标准菌株、23种临床培养分离株均进行三种探针的荧光定量检测:通用探针均为阳性,18株革兰阳性菌株通过革兰阳性探针(G+Probe探针)检测为阳性,17株革兰阴性菌株通过革兰阴性探针(G-Probe探针)检测为阳性,反之均为阴性,吻合率100%。结论建立了用通用引物和分型双荧光探针的细菌荧光定量PCR定量、分型方法。其检测方便,快速、敏感性和特异性高,符合率好,同时进行定量和分型,在病原菌检测方面具有推广及应用价值。

分子生物学诊断技术在孢子丝菌病中的应用进展

孢子丝菌病的致病菌是双相型申克孢子丝菌,传统的诊断方法对于孢子丝菌病的诊断及申克孢子丝菌的鉴定存在很大的局限性,难以满足临床诊断的需要。分子生物学诊断方法具有灵敏度高、特异性好、检测快速且可以在种、株水平对申克孢子丝菌病进行鉴定等优点,对于孢子丝菌病早期诊断及确定治疗方案和预后至关重要。