甘蓝型油菜根系突变体lrn1、prl1和野生型根系显微结构的差异

油菜外源细胞分裂素不敏感突变体lrn1和prl1表现为磷高效。营养液培养0.2μmol/L细胞分裂素(6-BA)处理,与甘蓝型油菜野生型‘宁油7号’(WT)相比,突变体lrn1侧根较多,prl1主根较长。本研究利用体式显微技术、非切片压片法以及石蜡切片等技术,对3个基因型在ddH2O和0.2μmol/L 6-BA处理下的根毛、根表皮细胞分化及根尖解剖结构的差异进行了观察,结果表明:ddH2O处理,种子发芽后第1、3、6、9 d,lrn1、prl1和WT根尖成熟区根毛较少。0.2μmol/L 6-BA处理,种子发芽后第3 d,lrn1、prl1和WT根尖形成大量根毛,其中WT根毛最多、密度最大;prl1根毛最少,密度也最小;lrn1处于两者之间。种子发芽后第6 d,lrn1、prl1和WT分生区和伸长区明显缩短,lrn1和prl1分生区面积无显著差异,但两者均显著大于WT;lrn1和prl1根冠细胞结构较正常,而WT根冠细胞结构畸形;lrn1皮层原细胞之间排列较WT和prl1紧密。种子发芽后第9 d,lrn1已有4条侧根,但prl1与WT无侧根形成。6-BA处理,prl1主根较长,与其根尖分生区面积较大密切相关;lrn1侧根较多,可能与中柱原细胞排列密度较高密切相关。

拟南芥PRL1多克隆抗体的制备及应用

【目的】制备拟南芥PRL1蛋白的多克隆抗体,并检测PRL1在拟南芥真叶中的积累情况。【方法】扩增拟南芥PRL1基因的CDS序列,将其克隆至原核表达载体pET-28a中,转化到BL21(DE3)表达菌,经IPTG诱导后,对诱导产生的PRL1重组蛋白进行镍柱亲和纯化。将制备的PRL1重组蛋白通过皮下注射免疫家兔,从抗血清中分离、纯化PRL1抗体。扩增拟南芥PRL1基因的启动子序列及其基因组DNA序列,将其克隆至植物表达载体pBI111L中,再转化到农杆菌GV3101中,利用农杆菌侵染法构建prl1回复株系。利用纯化的抗体检测PRL1在野生型、prl1点突变体、PRL1T-DNA插入突变体和prl1转基因回复系中蛋白积累量的差异。【结果】克隆了PRL1基因的CDS序列,成功构建了pET-28a-PRL1原核表达载体,实现了PRL1重组蛋白在大肠杆菌中的表达(包涵体)。克隆了PRL1基因的启动子序列及其基因组DNA序列,成功构建了pBI111L-PPRL1-Strep-gPRL1植物表达载体及prl1回复株系。制备获得了PRL1重组蛋白的多克隆抗体,用该抗体能够有效地在拟南芥样品中检测出一条分子质量约为54ku的蛋白,该蛋白在prl1点突变体中表达量下降,在PRL1T-DNA插入突变体中缺失,而在prl1回复株系中表达量升高,并且在分裂旺盛的幼嫩组织中PRL1积累量较高。【结论】成功制备了PRL1蛋白的多克隆抗体,可用于拟南芥中PRL1蛋白含量的检测。

黑鲷催乳素基因PRL1和PRL2在急性盐胁迫环境下的表达分析

【目的】明确催乳素基因(PRL1和PRL2)在黑鲷不同组织及不同盐度胁迫下的表达模式,为黑鲷养殖过程中最适盐度范围的确定提供参考依据。【方法】通过RT-PCR扩增黑鲷PRL1和PRL2基因,以ExPASy、NetNGlyc及SWISS-MODEL等在线软件进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR检测PRL1和PRL2基因在黑鲷不同组织及不同盐度胁迫下的表达情况。【结果】黑鲷PRL1基因开放阅读框(ORF)全长639 bp,共编码212个氨基酸残基,其编码蛋白分子量为23.32 k D,理论等电点(pI)为6.70;黑鲷PRL2基因ORF全长750 bp,共编码249个氨基酸残基,其编码蛋白分子量为28.31 kD,pI为8.37。黑鲷PRL1和PRL2蛋白均由1个为信号肽结构域和1个为Hormone 1结构域组成;黑鲷PRL1蛋白二级结构中α-螺旋占69.34%、无规则卷曲占30.66%,包含1个糖基化位点及37个磷酸化位点;黑鲷PRL2蛋白二级结构中α-螺旋占67.07%、无规则卷曲占32.93%,包含1个糖基化位点及21个磷酸化位点。黑鲷PRL1和PRL2基因在12个待检测组织中均有表达,且均以脑组织中的相对表达量最高,显著高于其他组织中的相对表达量(P<0.05,下同);在盐度5‰处理组中,黑鲷PRL1基因在胁迫4 h开始显著上调,黑鲷PRL2基因在胁迫8 h开始极显著上调(P<0.01),二者均在胁迫24 h时达峰值,随后开始缓慢下降,至胁迫72 h时其相对表达量仍显著高于对照组;在盐度25‰和35‰处理组中,黑鲷PRL1和PRL2基因在胁迫72 h时其相对表达量均显著低于对照组。【结论】低盐胁迫能促进黑鲷PRL1和PRL2基因的表达,高盐胁迫则抑制黑鲷PRL1和PRL2基因的表达,即黑鲷PRL1和PRL2基因在其适应淡水环境的过程中发挥重要调节作用。

睾丸间质细胞Prl3c1过表达转基因小鼠建立与生物学功能初步研究

目的建立睾丸prolactin family 3,subfamily c,member 1(Prl3c1)过表达转基因(TG)小鼠,并对其功能进行初步研究。方法设计引物扩增insulin like 3(Insl3)、Prl3c1、Insl3PA片段,通过融合PCR,形成Insl3-Flag-Prl3c1-Insl3PA片段,构建p Prl3c1转基因载体,测序验证。通过受精卵原核注射,建立TG小鼠。免疫荧光、Western blot方法鉴定转基因表达情况。采用ELISA方法检测3月龄TG小鼠与野生型对照(WT)小鼠睾酮基础水平;并测定5 U/10 g人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)刺激后,TG与WT小鼠睾酮水平(n=6)。结果免疫荧光与Western blot检测结果表明转基因片段表达于TG小鼠睾丸间质细胞。TG小鼠睾丸形态学未见明显异常。此外,TG小鼠基础睾酮水平与WT小鼠差异无统计学意义[(2.61±0.34)ng/m L vs(2.51±0.35)ng/m L,P>0.05],但在HCG刺激后,TG小鼠睾酮水平低于WT小鼠[(5.35±0.83)ng/m L vs(7.56±1.17)ng/m L,P<0.01]。Western blot检测结果表明Prl3c1过表达减弱HCG刺激的STAR表达(P<0.01)。结论成功建立了Prl3c1 TG小鼠,体内功能研究显示Prl3c1参与睾酮产生。