Pro-UK基因抑制静脉移植物细胞增生的实验研究

目的：探讨ＰｒｏＵＫ 基因对静脉桥移植物细胞增生的影响。方法：３００ ～３５０ｇ Ｗｉｓｔａｒ 大鼠４２ 只，取下大鼠颈静脉，两端阻断后，用含Ａｄｖ５ＣＭＶ 质粒（ 对照组，２１ 只） 或含Ａｄｖ５ＣＭＶＰｒｏＵＫ 质粒（ 治疗组，２１ 只） 的溶液扩张静脉，使溶液在静脉腔内滞留３０ 分钟，然后置于同一大鼠的颈总动脉。术后２８ 天，取静脉移植物行尿激酶原活性测定，观察ＰｒｏＵＫ 基因的表达。行３ＨＴＤＲ 掺入量测定和病理分析，观察静脉桥管壁增厚情况。结果：术后２８ 天，治疗组可测到较高水平的ＰｒｏＵＫ 表达（２６５ｉｕｇｔｉｓｓｕｅ） ，对照组未测到ＰｒｏＵＫ 活性。虽然两组的管壁均有不同程度的增厚，但治疗组管壁增厚明显小于对照组（ Ｐ＜ ０ ．０１） ，而管腔面积明显大于对照组（ Ｐ＜ ０ ．０１） 。３ＨＴＤＲ 掺入量比对照组低。治疗组１０ 条静脉桥全部畅通，而对照组１０ 条静脉桥有２ 条发生闭塞。结论：用静脉桥局部直接转基因的方法将腺病毒载体介导的ＰｒｏＵＫ基因转入静脉桥可明显抑制细胞增生，是提高静脉桥通畅率的一个有效方法。

重组人尿激酶原纯化中浓缩方法的比较

对尿激酶原纯化中的浓缩方法进行了探索,先后采用了3种不同的方法,即超滤、CM-阳离子柱、疏水色谱柱浓缩。结果表明,超滤只适合于大量样品的浓缩,样品量较小时损失较大,而且机械作用较强会使部分产品分解;CM-阳离子枉浓缩回收率较高,但得到的产品盐浓度高,还需要经过脱盐处理,增加了操作步骤,而疏水柱浓缩方法较为理想,经它浓缩后的产品用SDS-PAGE分析,非还原条件下,纯度在98％以上,还原条件下单链占90％以上,浓缩16倍,尿激酶原浓度达到3mg/ml以上。

重组人尿激酶原与尿激酶对急性心肌梗死患者纤溶系统影响的比较

目的 对比观察注射用重组人尿激酶原(Pro- UK)对全身纤溶系统的影响。方法 将114 例符合溶栓标准的急性心肌梗死患者随机给予不同剂量的Pro UK或尿激酶(UK)进行溶栓。其中Pro -UK 30 mg及40 mg组26 例,50 mg组29例,60 mg组28例;UK组31例。观察溶栓前和溶栓开始后2、24、48 h血浆纤溶酶原(PLG)、D 二聚体(D D)、组织型纤溶酶原激活物(t PA)、纤溶酶原激活物抑制物(PAI)、纤维蛋白原(Fib)的变化以及出血并发症,并于溶栓开始后90 min进行冠状动脉造影,比较Pro UK和UK组溶栓后的血管开通率。结果 各用药组溶栓开始后2 h的PLG及PAI活性较溶栓前显著降低(P<0.01),而D D和t PA活性较溶栓前显著升高(P<0.01);UK组溶栓开始后2 h Fib较溶栓前显著降低(P<0.01),而Pro UK各剂量组Fib降低不明显;以上所有变化在溶栓开始后24 h基本恢复;溶栓开始后2 h Pro UK各剂量组的Fib明显高于UK组(P<0.01),其他时间点各用药组之间的所有观测指标均无显著差异;各用药组之间梗死相关血管开通率和出血并发症均无显著差异;溶栓开始后2 h梗死相关血管开通组的PAI显著低于未开通组(P<0.01),其他指标无显著差异。结论 UK溶栓后对全身纤溶系统激活较明显,与UK比较Pro -UK对全身纤溶系统无明显激活作用。

T7 启动子作用下人尿激酶原 cDNA 在大肠杆菌中的高效表达及分离纯化

化学合成的人尿激酶原ｃＤＮＡ克隆在表达质粒ｐＥＴ１１ｄ中，在Ｔ７启动子的作用下，经０１ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ诱导，在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ中获得表达。其表达量占菌体总蛋白的１５％，表达产物以无活性的包涵体形式存在。经体外变复性，Ｚｎ２＋选择性沉淀，抗体亲和柱层析，及Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ亲和吸附，所表达的人尿激酶原被纯化为单一条带，其比活约１１００００ＩＵ／ｍｇ。

用多孔微载体大规模培养rCHO细胞

多孔微载体是近年来发展起来的一种用于大规模高密度培养动物细胞的支持物，具有许多优点，如：容易固定细胞，适合于贴壁细胞和悬浮细胞的固定化连续灌流培养；细胞生长在载体内部，增加了细胞固定化的稳定性，可降低血清用量，适合长期培养；能保护细胞免受机械损伤，增...

人尿激酶原乳腺定位转基因小鼠的建立

应用大鼠β乳酪蛋白基因的上游调控序列和人尿激酶原ｃＤＮＡ构建成功了乳腺定位表达载体．用显微注射的手段导入到受精卵的雄前核，从注射的３００枚受精卵中，１４０枚被移植到９只假孕的受体小鼠．结果从获得的子一代小鼠中，经ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证实，有３只转基因阳性的小鼠．

尿激酶原测定方法的改进及对CL-11G工程细胞表达尿激酶原水平稳定性的观察

通过对不同浓度的尿激酶标准品经不同保温时间后溶解圈大小的观察,我们对原来的纤溶板法进行了一些改进,使测定结果更可靠、精确,并可节省成本。用该法对CL-11G工程细胞表达尿激酶原水平的稳定性观察表明,经104次连续传代,其表达量始终保持在每10~6细胞500IU/d左右,符合生产细胞的要求。

心血管疾病基因治疗的基础研究Ⅳ．外源基因的在体表达

将ｐＮ２－ＬａｃＺ和ｐＮ２－ＣＭＶ－ＵＫ质粒直接注射到Ｗｉｓｔａｒ大鼠股四头肌，可以在肌肉中检测到这两种基因的表达产物。注射ｐＮ２－ＬａｃＺ质粒后７天，β－半乳糖苷酶的表达量最高，可达２．４８×１０－４Ｕ／ｇ组织，并且可持续表达３周以上。组织化学染色表明部分肌细胞内有ＬａｃＺ基因表达。当用脂质体介导时，注射含３０μｇ质粒的脂质体─ＤＮＡ复合物，β－半乳糖苷酶的活性同直接注射８０μｇ质粒时的活性无差别，直接注射ｐＮ２－ＣＭＶ－ＵＫ质粒后７天，单链尿激酶原含量最高，可达５５０ｎｇ／ｇ组织。基因注射后３个月仍可检测到单链尿激酶原。

尿激酶原测定方法的改进及对GL-11G工程细胞表达尿激酶原水平稳定性观察

该文对原来的纤溶板法进行了改进，使测定结果更可靠，精确，并节省成本。用该法对ＣＬ－１１Ｇ工程细胞表达尿激酶原水平的稳定性观察表明，经１０４代连续传代，其表达量终始保持在５５９．６±９６．３１ＩＵ／１０６细胞／天左右，符合生产细胞的要求。

心血管疾病基因治疗的基础研究Ⅱ．Pro－UK和t－pA基因的体外表达

构建了带有人的全长Ｐｒｏ－ＵＫ或ｔ－ｐＡ基因ｃＤＮＡ的逆转录病毒质粒ｐＮ２－ＣＭＶ－ＵＫ或ｐＮ２－ＣＭＶ－ｔＰＡ。重组质粒转染包装细胞ＰＡ３ｌ７后获得含假病毒的培养上清。用假病毒上清感染培养的血管平滑肌细胞（ＶｓＭＣ），经Ｇ４ｌ８筛选得到抗性集落。Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析表明，Ｐｒｏ－ＵＫ或ｔ－ｐＡ基因已整合到宿主细胞染色体。在转染的ＶＳＭＣ中，Ｐｒｏ－ＵＫ和ｔ－ｐＡ的含量分别为２６５ｎｇ／１０７细胞／２４小时和５．６ｎｇ／１０７细胞／２４小时。溶圈法测定结果证明，Ｐｒｏ－ＵＫ基因导入细胞后可以表达出有生物活性的尿激酶原。

尿激酶原基因cDNA在BHK21细胞中的表达

将人尿激酶原（Ｐｒｏ－ＵＫ）基因ｃＤＮＡ分别插入到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３的ＣＭＶ启动子和ｐＳＶ２－ｎｅｏ的ＳＶ４０启动子下游，构建了重组表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ＵＫ和ｐＳＶ２－ＵＫ，分别将这两种表达质粒以脂质体载体法转染ＢＨＫ２１细胞。ＥＬＩＳＡ检测结果表明，ｐｃＤＮＡ３－ＵＫ和ｐＳＶ２－ＵＫ在哺乳动物细胞中能够表达，７２ｈ表达量分别为２８．７ｎｇ／ｍｌ和１３．５ｎｇ／ｍｌ。

重组人尿激酶原半成品的稳定性观察

对干燥前尿激酶原半成品的稳定性进行了观察。将半成品分装为数管 (1 40 μl/管 ) ,分别放在 4℃ ,- 2 0℃和 - 70℃ ,用纤维蛋白平板溶解圈法和 SDS- PAGE扫描法观察其 3个月内的活性及纯度变化。结果表明在 4℃条件下 ,处于溶液中的尿激酶原稳定性最差 ,一周后活性由 5× 1 0 4IU/ml降至 2 .3 8× 1 0 4IU/ml,单链比例由 97.7%降至 88.3 %,二周后单链比例进一步下降至 43 .8%。贮存在 - 2 0℃和 - 70℃条件下活性稳定 ,但单链也要缓慢裂解 ,一周后单链比例由 97.7%分别下降到 93 .9%和 93 .5 %,3个月后分别为 83 .7%和 86 .2 %。

简析国民党政权内“英美派”产生的原因

“英美派”系指南京国民党政权内部一个主张在内政外交特别是外交上倾向英美的政治集团,它的产生既是南京国民党政权建立前后中国国内政治发展的结果,也是远东国际关系演变特别是中日民族矛盾激化的产物。

重组人尿激酶原(普佑克)经导管溶栓在急性下肢动脉血栓中的应用

目的分析重组人尿激酶原(普佑克)经导管溶栓在急性下肢动脉血栓中的临床疗效。方法急性下肢动脉血栓形成病人65例,其中普佑克组35例,采用普佑克经导管溶栓,对照组30例,采用尿激酶,观察溶栓前后变化。其中普佑克实验组22例(实验组)与尿激酶对照组(30例)比较,评价两组溶栓后动脉通畅情况和不良反应等。结果普佑克组35例病人,33例有效,2例无效,有效率为94. 3%[对照组30例,21例有效,9例无效,有效率为70%。两组病人术后踝肱指数(ankle brachial index,ABI)值较术前提高,差异有统计学意义(P <0. 05)。实验组与对照组比较,再通率更高,差异有统计学意义(P <0. 05)[两组不良反应发生率比较差异无统计学意义(P>0. 05)。随访病人均有不同程度的改善。结论普佑克经导管溶栓治疗急性下肢动脉血栓的效果明显优于尿激酶。

应用核型多角体病毒载体在家蚕和家蚕培养细胞中高效表达人尿激酶原cDNA基因

将人尿激原ｃＤＮＡ分别插入家蚕核型多角体病毒转移载体ｐＢＫ２８３和ｐＢＦ４中，构建成两个重组质粒。所构建的这两个重组质粒与野生型家蚕核型多角体病毒ＤＮＡ共转染家蚕培养细胞，经病毒斑实验筛选出含ｐｒｏ－ＵＫ ｃＤＮＡ的稳定重组病毒株ＢｍＮＰＶ－ｐｋ１和ＢｍＮＰＶ－ｐｋ２。将此两株蛋白平板溶圈测活法和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法分析细胞培养上清及细胞和家蚕的体液及组织，证实均有ｐｒｏ－ＵＫ表达。

注射用重组人尿激酶原溶栓治疗老年急性脑梗死的临床疗效及其对神经功能和生活质量的影响

目的探讨注射用重组人尿激酶原(rh-proU K)溶栓治疗老年急性脑梗死的临床疗效及其对神经功能和生活质量的影响。方法将120例老年急性脑梗死患者依据治疗方案及rh-proU K使用剂量分为高剂量组、低剂量组及对照组,每组40例,入院后均进行内科常规治疗,对照组同时给予(rt-PA),高剂量组给予rhproU K 50 mg,低剂量组给予rh-proU K 35 mg。检测三组治疗前及溶栓后24 h血流动力学、神经功能相关因子水平,于治疗后3个月行神经功能及生活质量评分。结果治疗后,三组V_(mean)、V_(max)、V_(min)、Q_(mean)均升高,R、GFAP、S-100B、NSE、MBP降低(P<0.05或P<0.01);与对照组比较,高、低剂量组V_(mean)、V_(max)、V_(min)、Q_(mean)均升高,R、GFAP、S-100B、NSE、MBP降低(P<0.05或P<0.01);与低剂量组比较,高剂量组Vmin升高,R降低(P<0.05或P<0.01);高、低剂量组各项神经功能因子比较差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后3个月,与对照组比较,高、低剂量组Barthel指数、SF-36评分升高,NIHSS评分降低(P<0.05或P<0.01),三组间MMSE评分比较差异无统计学意义(P>0.05);高、低剂量组各神经功能评分、SF-36评分比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论注射用重组人尿激酶原治疗老年急性脑梗死疗效确切,可迅速溶解血栓、恢复脑组织灌注,促进机体神经功能的恢复,改善患者预后,同时低剂量即可维持较好的治疗效果。

重组人尿激酶原对补救性经皮冠状动脉介入治疗患者的疗效观察

(1)目的观察超选择性冠脉内应用重组人尿激酶原对补救性经皮冠状动脉介入治疗(PCI)患者的疗效。(2)方法选取连续就诊于唐山市工人医院行补救性PCI的58例患者为研究对象,其中男42例,女16例。随机分为尿激酶原组(PCI术中经抽吸导管于冠脉靶病变远端注射重组人尿激酶原联合血栓抽吸)30例与对照组(PCI术中经抽吸导管于冠脉靶病变处行血栓抽吸)28例。比较两组患者术前心功能KILLIP分级、TIMI 0级血流人数、左室射血分数(LVEF)及左室舒张末期内径(LVEDD);术后TIMI 3级血流人数、校正的TIMI血流帧数(CTFC)、2小时ST段回落情况及术后30天LVEF、LVEDD、主要不良心血管事件(MACE)和出血事件等发生的差异。(3)结果两组患者在年龄、性别、高血压、糖尿病、高脂血症、吸烟等一般资料及罪犯血管、植入支架数量等手术资料方面均无统计学意义(P>0.05);两组术后2小时心电图ST段回落情况、CTFC、TIMI 3级血流人数及术后30天LVEF、LVEDD比较,差异均有统计学意义(P <0.05),术后30天MACE事件发生率、出血情况均无统计学意义(P>0.05)。(4)结论补救性PCI患者冠脉内应用重组人尿激酶原可以有效改善心肌组织灌注,降低MACE事件且不增加出血风险。

携带人尿激酶原cDNA的重组腺病毒载体的构建及其在体内的表达

目的 构建表达人尿激酶原的重组腺病毒载体,为临床基因治疗提供实验依据。方法 采用亚克隆获得的pCA14-pro-UK重组质粒与质粒pJM17共转染培养的293细胞,经同源重组,得到含有pro-UKcDNA的重组腺病毒。扩增纯化后,局部转染经球囊损伤后的兔股动脉。7d后,分别收集转染的血管段和对照血管段,以Western印迹和免疫组化检测表达。结果 (1)经PCR扩增及体外感染A549细胞结果表明,获得了具有生物活性的含人pro-UKcDNA的重组腺病毒;(2)重组腺病毒的滴度为1×109噬菌斑形成单位/ml(PFU/ml);(3)免疫组化及Western印迹分析显示:重组腺病毒能在损伤的兔股动脉内膜表达尿激酶原。结论 构建得到的携带人尿激酶原cDNA的重组腺病毒能在损伤血管部位表达。

声学微泡联合重组人尿激酶原与单纯应用重组人尿激酶原对急诊经皮冠状动脉介入治疗前降支无复流患者近中远期心功能的影响分析

目的探讨声学微泡联合重组人尿激酶原与单纯应用重组人尿激酶原对急诊PCI前降支无复流患者近中远期心功能的影响.方法选取贵州医科大学附属医院2017年1月至2018年12月急诊入院行PCI治疗前降支无复流的患者.同意行声学微泡联合重组人尿激酶原治疗的患者45例作为治疗组,同意单纯应用重组人尿激酶原治疗的患者34例作为对照组.记录患者入院时的一般资料,术中治疗组应用声学微泡联合重组人尿激酶原,对照组仅应用重组人尿激酶原.分析两组患者PCI术后30 min的TIMI血流情况,记录两组患者住院期间的心功能指标及不良事件发生情况,记录术后6、12个月随访时的超声心动图指标及不良事件发生情况.结果两组患者的一般资料情况无明显差异.治疗组PCI术后30 min的TIMI血流明显优于对照组(2.11±0.49比1.00±0.34,P<0.01).术后1周内、6个月、12个月时治疗组的左心室射血分数(LVEF)[(42.71±4.67)%比(45.90±4.48)%;(44.62±4.60)%比(49.65±4.50)%;(52.20±5.49)%比(56.03±4.25)%]、左心室收缩末期内径(LVESD)[(39.80±3.47)mm比(33.75±2.87)mm;(39.54±4.66)mm比(32.89±5.10)mm;(38.85±3.97)mm比(29.8±5.23)mm]、左心室舒张末期内径(LVEDD)[(47.60±2.53)mm比(44.15±2.12)mm;(50.38±5.12)mm比(45.16±4.57)mm;(51.38±3.96)mm比(48.26±5.49)mm]均优于对照组(P均<0.05).治疗组术后1周、6个月、12个月时的总不良事件发生率明显低于对照组[10(29.4)比5(11.1);16(50.00)比9(21.95);22(75.86)比10(25.64),P均<0.05].术后6个月时治疗组的病死率低于对照组[3(9.4)比1(2.4),P<0.05];术后12个月时治疗组非致死性心肌梗死发生率低于对照组[6(20.69)比2(5.13),P<0.05].结论与单纯应用重组人尿激酶原相比,声学微泡联合重组人尿激酶原可以明显改善心肌梗死后前降支无复流患者的心功能,降低心肌梗死后近中远期的总体不良事件发生率.

尿激酶型纤溶酶原激活剂治疗血栓栓塞性疾病的研究

尿激酶型纤溶酶原激活剂（u-PA／Pro—UK）是第二代溶栓剂，具有纤维蛋白特异性。多项Pro-UK治疗急性心肌梗死的随机对照试验证实，其早期冠脉开通率高，再栓率低。动脉内局部应用Pro—UK治疗急性缺血性脑卒中，可以将溶栓窗延长至6个小时，并明显改善预后。Pro—UK应用于急性大面积肺栓塞可以改善血流动力学指标，是一种理想的溶栓剂。