获能和冻融猪精子前顶体蛋白活化机制研究

利用SDS-PAGE和Western Blotting的方法,分析冻融和获能处理中猪精子前顶体蛋白的转化过程。结果表明,显示获能组精子荧光区域大于冻融组精子,而小于新鲜精子组;新鲜组精子出现大约45和35kDa分子量的条带,而冻融和获能组精子都同时出现大约45、35和28kDa分子量的条带。总之,冻融后顶体完整的精子和获能精子Proarosin都能正常活化成α-acrosin、β-acrosin和28kDa,这个途径可作为预测受精的指标。

精子蛋白32的表达及酪氨酸磷酸化调控猪精子顶体蛋白的活化

为了探究猪精子蛋白32(Sperm protein,sp32)表达及酪氨酸磷酸化调控猪精子顶体蛋白活化的关系,本研究对不同处理(鲜精、冷冻-解冻、获能、顶体反应)的猪精子顶体膜蛋白进行分离,通过考马斯亮蓝染色、SDS-PAGE电泳和Western blot检测和分析。结果表明,猪精子经过获能处理、冷冻-解冻处理以及顶体反应处理后,前顶体蛋白(Proacrosin)和顶体蛋白(Acrosin)在转化过程中,sp32表达有所差异,获能和顶体反应处理的sp32的表达量略高于冷冻-解冻处理组,而显著高于鲜精处理组。与其他处理组相比,冷冻-解冻精子处理组sp32酪氨酸磷酸化水平产生显著的差异。但在SDS-PAGE电泳中,猪鲜精处理组在蛋白质分子质量38～170ku区间的蛋白表达条带较其他对比组明显,这表明猪精子在受精前所必需经历的获能和顶体反应过程中,顶体膜蛋白伴随着大分子的蛋白质修饰和降解。结论:sp32作为一种前顶体蛋白结合蛋白,在前顶体蛋白活化过程中它的表达水平及酪氨酸磷酸化水平上调。

人顶体蛋白酶原基因片段的克隆及与β-半乳糖苷酶基因(LacZ)的融合基因载体的构建

为确定人顶体蛋白酶原基因特异的基因表达调控和蛋白分选的序列 ,从血白细胞中抽提人基因组 ,聚合酶链式反应 (PCR)扩增该基因 5’侧翼序列和第 1外显子。将扩增获得的 1.3Kb片段克隆到 pGEM T中 ,经酶切鉴定和DNA序列测定确定为人顶体蛋白酶基因片段。将上述基因片段克隆到pGEM 4Z中 ,适当酶切后与pSV β Galactosidase中经酶切去除SV40早期启动子的两片段连接 ,最终获得人顶体蛋白酶基因的 5’侧翼序列和第 1外显子与LacZ的融合基因载体 ,以及人顶体蛋白酶原基因

用于人顶体蛋白酶原基因表达调控和蛋白分选研究的转基因小鼠模型的建立

分别将构建的人顶体蛋白酶原基因 (humanproacrosin ,hACR) 5’侧翼序列 ,第 1外显子和编码 β 半乳糖苷酶的基因 (lacZ)的融合基因 (载体 1 ) ,以及hACR基因 5’侧翼序列与报告基因lacZ的融合基因 (载体 2 ) ,通过显微注射受精卵法制备转基因小鼠 ,结果如下 :载体 1 :注射 89只卵 ,移植入 9只母鼠单侧输卵管中 ,3只怀孕 ,产仔9只 ,存活 7只 ,基因组Southern杂交检出整合有外源基因的阳性小鼠 1只 ,阳性率 1 4 .3% ;子 1代 1 5只 ,基因组Southern杂交 5只阳性。载体 2 :注射 2 35只卵 ,移植入 1 4只母鼠单侧输卵管中 ,4只怀孕 ,产仔 1 1只 ,存活 1 0只 ,基因组Southern杂交检出整合有外源基因的小鼠 1只 ,阳性率 1 0 .0 %。子 1代小鼠 1 0只 ,基因组Southern杂交 3只阳性。进一步将检测lacZ在转基因小鼠体内的表达。