原核Argonaute的应用研究进展

原核生物Argonautes(pAgos)是参与细胞防御外来DNA入侵的可编程核酸酶。在体外,pAgos可以结合小的单链核酸(ssDNA/ssRNA)向导来识别和切割互补DNA/RNA。在体内,pAgos优先靶向多拷贝遗传元件、噬菌体和质粒,从而抑制入侵核酸的扩增和噬菌体感染。pAgos作为一类新兴的可编程核酸酶,比目前应用最为广泛的CRISPR-Cas系统更具灵活性,在生物技术方面展现出巨大的潜力。早期的研究聚焦于嗜热的pAgo,目前基于嗜热pAgos的主要应用包括分子诊断和体外DNA组装。为了推进基于Ago的体内生物技术,如基因编辑的应用,研究人员的焦点逐渐转移到中温生物来源的pAgos,虽然目前pAgos还未实现基因组编辑,但是随着越来越多的pAgo被发掘以及研究人员对pAgos催化机制的深入研究,有望开发基于pAgos的下一代基因编辑技术。本文总结了已知代表性pAgos和基于pAgos发展的生物技术,并简要分析了pAgos在原核生物和真核生物体内应用面临的挑战和可能的应对策略。

绿僵菌Argonaute基因片段原核表达载体的构建及其表达

绿僵菌是一类广泛应用于生物防治的昆虫病原真菌。研究表明小RNA能够调控基因的表达,其中Argonaute基因在整个小RNA通路中发挥重要的作用。本研究通过RT-PCR的方法从绿僵菌中获得了Argonaute基因的部分功能片段,构建了其重组原核表达载体,将重组载体转化至大肠杆菌进行诱导表达;采用镍柱亲和纯化重组的目的蛋白并通过Western blot技术鉴定。结果发现:通过RT-PCR的方法获得长度约为950bp的基因片段;重组原核表达载体经诱导表达后,SDS-PAGE检测发现分子量约为34kDa的目的蛋白条带;诱导5h后蛋白的表达量最高,采用镍柱亲和层析纯化重组蛋白,经Western blot技术检测,重组蛋白可与His-tag抗体发生特异性反应。该纯化重组蛋白的获得为将来绿僵菌Argonaute蛋白抗体的制备,并进一步通过该抗体获得绿僵菌体内的小RNA及其靶基因提供了基础。

原核Argonaute蛋白介导的干扰作用及其应用

Argonaute(Ago)蛋白是具有核酸结合能力的蛋白质,有些具有核酸内切酶活性。Ago蛋白在生物体中普遍存在,过去人们主要关注来源于真核生物的真核Ago蛋白,它可以结合小干扰RNA组成RNA诱导沉默复合体,是RNA干扰途径中的重要一环。近年来,人们开始关注原核Ago蛋白。与真核Ago蛋白不同,原核Ago蛋白的结构更加多样,可以分为长型原核Ago蛋白、短型原核Ago蛋白和PIWI-RE这三大类,而且更倾向于结合单链DNA进行DNA干扰。不同的原核Ago蛋白通过DNA引导的DNA干扰、RNA引导的DNA干扰等体内干扰途径,利用其识别和结合核酸的能力、核酸酶活性或与其他核酸酶协同作用来抵御外来核酸,为宿主提供免疫保护。由于部分原核Ago蛋白具有对DNA链或RNA链的靶向识别和切割能力,因此可以开发为可编程人工限制性内切酶,还能应用在核酸检测、基因突变检测、荧光原位杂交技术等方面,并且在基因编辑方面具有巨大的应用潜力。概述了Ago蛋白的分类、生理功能,以及原核Ago蛋白的体内干扰途径及其应用前景。

ZmAGO18b的原核表达载体的构建与表达

AGO18是禾本科植物中特有的Argonautes(AGOs)蛋白的一个分支,在植物生殖器官发育和逆境胁迫过程中发挥着重要的调控作用。玉米中AGO18b(ZmAGO18b)的表达具有很强的组织特异性,在雄穗小孢子减数分裂时期特异富集。为了研究ZmAGO18b基因的功能,本研究从减数分裂时期的玉米雄穗cDNA中特异扩增Zm AGO18b的全长ORF(2760 bp),利用酶切连接的方法构建原核表达载体,通过大肠杆菌表达菌株(Transetta)进行IPTG诱导表达。结果显示,ZmAGO18b蛋白最佳诱导条件是IPTG终浓度0.10 mmol/L,诱导温度是37℃,诱导时间为3 h,此时体外表达的蛋白量达到最高,蛋白大小约为100 kD。本研究有助于后期对ZmAGO18b蛋白的分离与纯化,为进一步抗体制备及相关功能研究积累了有价值的资料。