光谱法研究细胞色素C与proliNONOate之间的相互作用

细胞色素C(Cytochrome,Cyt c)作为细胞内线粒体的电子传递体,与NO之间的相互作用结果对于线粒体凋亡的检测有着重要的生物学意义。采用紫外-可见(UV-Vis)吸收光谱、电子顺磁技术(EPR)、时间过程光谱、圆二色(CD)光谱和同步荧光光谱等方法对处于不同价态的Cyt c与NO替代物,即proliNO/NO(proliNONOate)的相互作用过程,以及Cyt c在结合NO过程中蛋白空间结构的变化进行了详细研究。实验结果发现:在模拟生理条件下,不同价态的Cyt c都能够直接与NO替代物(proliNO/NO)所产生的NO发生配位反应。推断出Cyt c与NO之间相互作用发生的可能机制:NO与Cyt c结合过程,是因为与Cyt c中Fe配位的轴向配体以及卟啉周围的取代基变化而发生结合的。具体反应过程为:溶液中的NO诱导Cyt c中的Heme上Met80远离原来位置,Fe—S键断裂,进而空出的Fe与NO结合生成Fe—N键,从而生成新的Cyt c-NO配合物。研究表明:Cyt c-NO二元复合物不稳定,会发生光解离反应,通过线性拟合得出:其解离过程属于准一级反应,解离速率为(0.071 1±0.039 6)s^(-1)。同时,血红素Fe与NO间新键的形成,影响了色氨酸和酪氨酸微环境的变化;Cyt c二级结构受proliNO/NO浓度的影响,当proliNO/NO浓度低于8.6×10^(-4) mol·L^(-1)时,Cyt c的α-螺旋特征峰强度变化很小,且位置不变;但proliNO/NO浓度高于8.6×10^(-4) mol·L^(-1)时,即过量,Cyt c的二级结构变化很明显,说明过量的NO能导致Cyt c二级结构的破坏。NO与Cyt c配位反应机制的研究对于利用NO抑制线粒体内的氧气消耗,以及线粒体内NO的代谢具有重要的意义。

细胞色素c与NO相互作用的光谱研究

目的:为了探究NO与细胞色素c(Cyt c)的结合反应过程以及其对血红素蛋白构象的影响。方法:本文采用紫外-可见吸收光谱、荧光光谱、同步荧光光谱、圆二色等光谱法研究不同价态Cyt c、不同影响因素下,Cyt c直接与NO之间的结合反应,并且阐述了NO与Cyt c反应的荧光猝灭机制。结果表明:NO更容易与三价铁Cyt c(Cyt c-Fe(III))反应。NO不仅能与蛋白质氨基酸侧链弱结合,还能与血红素铁发生紧密结合。通过荧光猝灭机制可知:NO与Cyt c结合为静态猝灭,二者以静电引力等弱结合力结合,结合位点数为1。同时,受NO诱导作用,Cyt c中血红素Fe-S键变弱促进NO与Cyt c的紧密结合。二者结合受到NO浓度的影响。溶液中游离芳香族氨基酸均促进两者结合反应,其中Tyr促进作用最强;355 nm激光照射促进NO与Cyt c的结合;但有Phe、Trp残基存在时激光照射却阻碍了结合作用。NO与Cyt c的结合会改变Cyt c蛋白构象及周围氨基酸残基的微环境,导致肽链伸展,极性增强。意义:本文结果对于进一步研究NO气体小分子与血红素蛋白结合以及在不同因素条件下对血红素环境的影响有重要意义。