PRP基因绿色荧光蛋白载体构建及其生物学功能初步研究

目的:构建Prolifein related protein(PRP)基因荧光表达载体,并初步探讨其生物学功能。方法:提取小鼠睾丸RNA,RT-PCR扩增PRP基因编码区片段,酶切连入pEGFP-C1载体,构建含有PRP基因片段的绿色荧光表达载体PRP-pEGFP-C1。为了探讨PRP基因功能,PRP-pEGFP-C1经Lipofectamine 2000介导转染293FT细胞,MTT实验分析细胞增殖变化,流式细胞仪分析细胞周期分布。结果:质粒PRP-pEGFP-C1经测序验证,证实PRP基因已正确连入pEGFP-C1载体。免疫荧光染色显示PRP定位于293FT细胞胞浆。MTT结果表明,上调PRP基因引起293FT细胞增殖活性下降,细胞周期分布情况提示G1期细胞增加,S期细胞减少。结论:成功构建PRP-pEGFP-C1荧光表达载体,对其功能研究表明PRP具有抗人293FT细胞增殖,扰乱细胞增殖周期的功能。本研究为PRP在抗人肿瘤方面的研究提供基础。

PRP基因RNAi重组慢病毒制备及PRP基因与睾丸间质细胞增殖和睾酮产生的关系

目的制备PRP RNAi重组慢病毒,并对PRP基因功能进行初步研究。方法采用miRNA方式抑制PRP基因表达,筛选最有效序列包装慢病毒,用于转染TM3睾丸间质细胞。转染实验分为TM3-negative对照组(阴性对照质粒组,转染pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg control质粒)以及A、B、C 3个干扰质粒组(分别转染pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-PRP-A,B,C质粒);RT-PCR与Western blot方法检测慢病毒对PRP基因表达影响,MTT方法检测细胞增殖情况,ELISA方法检测细胞睾酮产生情况。结果经测序鉴定,成功制备了PRP RNAi重组慢病毒;与阴性对照质粒组比较,转染pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-PRP-A,B组可有效下调TM3细胞PRP mRNA和蛋白表达(P<0.01,P<0.05)。MTT结果表明抑制PRP基因后,TM3细胞的增殖加快(P<0.01)。此外,相较于对照组,下调PRP基因抑制促黄体生成素(luteinizing hormone,LH)刺激产生睾酮的效应(P<0.05)。结论成功制备了PRP RNAi重组慢病毒,对其功能初步研究显示,PRP不仅与睾丸间质细胞增殖有关,而且参与睾酮产生。

丁酸钠联合顺铂对卵巢透明细胞癌ES-2细胞活性及增殖的影响

目的观察丁酸钠联合顺铂对卵巢透明细胞癌ES-2细胞活性及增殖的影响。方法将对数生长期的卵巢透明细胞癌ES-2细胞随机分为观察组和对照组。观察组分别加入1、2、4、6 mmol/L的丁酸钠和5μg/m L顺铂,对照组分别加入与观察组相同浓度的丁酸钠。采用MMT法检测两组细胞活性,Western blotting法检测两组凋亡蛋白(c-PAPP、c-Caspase-3)和增殖蛋白(ERK、p-ERK)相对表达量。结果观察组加入1、2、4、6 mmol/L丁酸钠和顺铂细胞活性分别为51%±3%、39%±2%、22%±2%、11%±1%,多组间及组内两两比较,P均<0.05;对照组加入1、2、4、6 mmol/L丁酸钠细胞活性分别为88%±4%、76%±3%、69%±2%、54%±2%,多组间及组内两两比较,P均<0.05;两组加入相同浓度丁酸钠细胞活性比较,P均<0.05。随着丁酸钠浓度增加,两组凋亡蛋白cPAPP、c-Caspase-3相对表达量逐渐升高,增殖蛋白ERK、p-ERK相对表达量逐渐降低。与对照组同浓度丁酸钠比较,观察组1、2、4、6 mmol/L丁酸钠和顺铂c-PAPP、c-Caspase-3蛋白表达均升高,1、6 mmol/L丁酸钠和顺铂ERK、pERK蛋白表达均降低;两组比较,P均<0.05。结论丁酸钠联合顺铂可降低卵巢透明细胞癌ES-2细胞活性,抑制其增殖、促进其凋亡;丁酸钠浓度越高,上述作用越明显。

转录共刺激因子对结直肠癌基质金属蛋白酶及相关蛋白的影响

目的:探讨转录共刺激因子(TAZ)对结直肠癌基质金属蛋白酶及相关增殖蛋白的影响,分析其影响结直肠癌肿瘤生物学行为的可能作用机制。方法:采用合成TAZ小干扰RNA(TAZ-siRNA)转染结直肠癌细胞株HCTT116抑制TAZ表达,检测细胞活性、侵袭迁移能力、细胞凋亡,采用实量定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测TAZ与基质金属蛋白酶mRNA表达,采用Western blot法相关蛋白表达。结果:转染组TAZ mRNA与蛋白表达均明显低于对照组与空白组(t=27.116、17.600、24.051、16.168,P<0.01);HCT116细胞活性、侵袭迁移能力均明显低于对照组与空白组,细胞凋亡率均明显高于对照组与空白组(t=12.944、17.613、20.489、12.639、18.324、20.051,P<0.01);基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)等mRNA表达均明显低于对照组与空白组,金属蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)mRNA表达均明显高于对照组与空白组(t=13.588、10.041、6.678、13.164、10.479、6.705,P<0.05或<0.01);B细胞淋巴瘤/白血病-2(bcl-2)蛋白表达均明显低于对照组与空白组,bcl-2相关X蛋白(bax)、细胞色素C(Cyt C)表达均明显高于对照组与空白组(t=9.358、7.670、15.205、19.163、5.937、17.063,P<0.05或<0.01)。结论:抑制转录共刺激因子(TAZ)能够抑制结直肠癌肿瘤细胞增殖与转移,可能与调节基质金属蛋白酶、相关蛋白表达水平有关。