人PNRC基因启动子的初步鉴定

PNRC(proline-rich nuclear receptor coactivator)是最近发现的一种新的核受体辅活化子,它是以牛类固醇生成因子-1(SF1)作诱饵,利用酵母双杂系统从人乳腺cDNA表达文库中筛选得到的.为了研究人PNRC基因的表达调控机制,在对人PNRC基因的生物信息分析的基础上,采用5′RACE法确定了PNRC基因的转录起始位点,克隆了人PNRC基因的5′侧翼区,并对该区进行功能分析.分别构建了11种含不同长度启动子序列的荧光素酶报告基因表达质粒,将它们瞬时转染HepG2细胞,检测其荧光素酶活性.结果发现,PNRC的5′侧翼区的-323^+27、-323^+57、-123^+57、-123^+27区域的启动子活性显著升高,其中-323^+27区域的启动子活性最高.研究表明,人PNRC基因启动子的最小区域位于PNRC的5′侧翼区的-123^+27区域.

NFY和RFX1对人PNRC启动子的调控作用

探讨核因子Y(nuclear factor Y,NFY)和调节因子X1(regulatory factors that bind to the X box,RFX1)对人PNRC(proline-rich nuclear receptor coactivator)基因的调控作用及机制.根据凝胶电泳迁移率变化实验,分析NFY和RFX1与PNRC启动子区域的结合.将含有NFY和RFX1的真核表达质粒(pCMV-NFY,pCMV-RFX1)和含有PNRC启动子的荧光素酶报告基因质粒共转染HepG2细胞,检测转染细胞的荧光素酶活性,并用RT-PCR和Western印迹检测PNRC的表达情况.Quick-Change法对PNRC启动子区NFY和RFX1结合位点进行突变,将包含突变点的重组荧光素酶报告质粒与含有NFY和RFX1的真核表达质粒共同转染HepG2细胞,检测各组荧光素酶活性.结果发现,NFY和RFX1能与PNRC启动子区域特异性结合;转染pCMV-NFY和pCMV-RFX1可抑制PNRC启动子活性并下调PNRC在HepG2细胞中的表达;包含NFY和RFX1结合位点的突变质粒与pCMV-NFY和pCMV-RFX1共转染后,NFY和RFX1对PNRC启动子活性的抑制作用消失.以上结果提示,NFY和RFX1能调控PNRC基因的表达,其机制是与PNRC启动子区域的特异性结合位点相结合,发挥其反式抑制作用.

核受体及核受体辅活化子对芳香族化酶基因转录调控的研究

目的 研究核受体及核受体辅活化子对芳香族化酶基因转录的调控。方法 酵母单、双杂合筛选、蛋白质 蛋白质相互作用分析、DNA突变、报告基因转染功能分析、迁移率改变及足迹分析等技术。结果 ①鉴定了主导芳香族化酶基因在乳腺癌细胞中表达的启动子I.3和启动子Ⅱ的确切位置以及对这两个启动子起调节作用的沉默子 (Silencer)S1和cAMP效应要素 (CREaro)等顺式作用元件。②分离鉴定了能与类固醇衍生因子 1 (SterodogenicFactor1 ,SF1 )相互作用并参与芳香族化酶基因转录调控的转录因子 ,其中近 5 0 %的克隆编码两种新的富含脯氨酸的核受体辅调节蛋白质 ,命名为PNRC(Proline richNuclearReceptorCoactivators)。功能分析显示PNRC通过与SF1或ERR1相互作用 ,进一步增强SF1或ERR1对芳香族化酶基因启动子 1 .3的转录激活作用。③缺失突变及定点突变分析证明含SH3结合模体的 2 3个氨基酸残基区域是PNRC分子与核受体的相互作用位点。结论 我们鉴定了主导芳香族化酶基因在乳腺癌细胞中表达的启动子及调控序列 ,克隆了与DNA调控序列结合的蛋白质和通过蛋白质相互作用参与芳香族化酶基因转录调控的转录因子———一种新型的核受体辅活化子PNRC。

核受体辅活化子的家族新成员——PNRC

富含脯氨酸的核受体辅调节蛋白(proline-rich nuclear receptor coregulatory protein,PNRC)是一种普遍存在的核受体辅活化子,它能以配体依赖和非依赖方式与多种核受体相互作用并增强它们介导的转录激活。此外,它还能与Grb2和RNApol Ⅲ的RPC39亚基相互作用,参与生长因子/Ras信号通路和RNApol Ⅲ转录的调节。其在乳腺癌和癌旁正常组织中的表达差异使其有望成为治疗乳腺癌的新靶点。