叠氮丙啶-实时荧光聚合酶链式反应-高通量测序技术鉴定冷链食品中多种病原菌

目的 应用叠氮丙啶-实时荧光聚合酶链式反应-高通量测序技术鉴定冷链食品中多种病原菌,构建病原菌分子进化树。方法 以冷链食品中的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特氏菌5种病原菌作为研究对象,应用叠氮丙啶-实时荧光聚合酶链式反应技术作为冷链食品中病原菌检测初筛手段,应用微生物培养法以及生化鉴定仪器法进行方法比对与结果验证,运用高通量测序以及分子进化树构建作为冷链食品中所分离病原菌的种属地位确证方法。结果 叠氮丙啶-实时荧光聚合酶链式反应技术成功扩增了冷链食品中生活状态病原菌的特征性核酸片段,排除了死亡细菌以及阴性对照菌的干扰,病原菌检出限可达到1×10^(3)CFU/mL,一次反应可检测42份试样,可以在18 h内完成检测工作。在冷链食品中病原菌抽样检测调查中,随机采集的751份冷链食品,共检出62株病原菌,病原菌总体检出率为8.3%(62/751)。通过后续的16S rRNA测序以及葡萄球菌属、弧菌属以及李斯特菌属分子进化树的构建,成功溯源了金黄色葡萄球菌的污染来源并完成病原菌种属定位。结论 本方法特异性好、灵敏度高、检测通量高,为冷链食品及相关食品中病原菌的精确检测与溯源分析提供新的思路与方法。

肉制品生产工艺对沙门氏菌活的非可培养状态的诱导及检测方法研究

目的探索肉制品生产工艺对活的非可培养(viable but non-cultruable,VBNC)状态沙门氏菌的诱导因素,并建立一种快速检测肉制品中VBNC状态沙门氏菌的检测方法加以应对。方法通过高温、低温、高渗透压、防腐剂、杀菌剂等生产工艺处理获取VBNC状态沙门氏菌,使用脱氧胆酸钠(sodium deoxycholate,SD)和PMAxx处理菌液,依据ttr基因进行荧光定量聚合酶链式反应(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)建立SD-PMAxx-qPCR进行检测。采用人工污染的方式对VBNC状态沙门氏菌进行检测和验证。结果65℃处理40 min可使沙门氏菌快速进入VBNC状态,添加0.1 g/L山梨酸冷藏状态可使少量沙门氏菌缓慢进入VBNC状态。SD-PMAxx-qPCR能显著区分沙门氏菌的存活状态,最佳条件为0.08%SD,20μmol/L PMAxx,黑暗孵育10 min、光解10 min。纯培养时活菌的检出灵敏度为100 CFU/mL,添加高浓度死菌时,检出灵敏度不变。通过人工污染添加至样品时,需要对样品进行涂布确认其沙门氏菌不可培养,通过100℃加热样品10 min作为阴性对照,从而通过对比循环阈值实现样品中VBNC状态沙门氏菌的检测。结论沙门氏菌在肉制品生产过程中容易受到多种因素诱导进入VBNC状态,本研究建立了SD-PMAxx-qPCR快速区分沙门氏菌的存活状态,可用于肉制品中VBNC状态沙门氏的检测,为肉制品安全生产提供技术保障。

PMA-qPCR联用快速检测苹果中扩展青霉活菌

目的:为建立一种叠氮溴化丙锭(Propidium Monoazide,PMA)与实时定量聚合酶链式反应(Quantitative real-time Polymerase Chain Reaction,qPCR)联用的快速检测扩展青霉活菌方法。方法:通过优化PMA处理浓度、黑暗孵育及曝光时间,筛选扩展青霉特异性引物,结合qPCR技术,建立一种基于PMA-qPCR联用快速检测扩展青霉活菌的方法,构建定量标准曲线,应用于人工污染的苹果样品中活菌的检测,与平板菌落计数比较评估该方法的可靠性。结果:PMA处理浓度10μg/mL、黑暗孵育5 min、曝光10 min为最佳PMA处理条件。4种引物中Pexp-patF对扩展青霉具有极强的特异性,可作为引物用于PMA-qPCR检测。构建的定量标准曲线的R2=0.9948,最低检测限为102.6 CFU/mL,方法检测结果与平板菌落计数无明显差异,并发现在苹果的未腐烂部分中可检测出扩展青霉活菌。结论:研究建立的PMA-qPCR技术可应用于苹果中扩展青霉活菌的检测,为扩展青霉精准防控提供一定技术支撑。

PMA与PCR结合的细菌活细胞检测方法

基于PCR的分子生物技术在检测过程中不能有效区分样品中细菌的死活状态,这会导致对细菌数量的错误估计.文中用叠氮溴化丙锭(PMA)对样品基因组提取进行前处理,使PMA与样品中死细胞的DNA分子共价交联,并抑制该DNA分子的PCR扩增.结果表明:当样品中PMA质量浓度大于3μg/mL、曝光时间大于3 min时,PMA可抑制细胞膜破裂的E.coli死细胞DNA的PCR扩增;PMA质量浓度高于50μg/mL时对活细胞DNA的PCR扩增有一定影响;当浊度小于10NTU时,PMA能有效地抑制死细胞DNA的PCR扩增,而当浊度大于100NTU时,PMA失去效果.

PMA-qPCR方法快速检测活性E.coli O157:H7

建立将叠氮溴化丙锭(PMA)与定量PCR(qPCR)技术结合,用于检测热灭活菌背景条件下的大肠杆菌活菌的方法。结果表明:5min以上的强烈光照可以使PMA与DNA共价交联,同时完全钝化游离的PMA以避免"假阴性"结果;抑制死菌DNA扩增的最低PMA质量浓度为10μg/mL,不抑制活菌DNA扩增的最高PMA质量浓度为20μg/mL。当活菌/总菌大于1%时,经PMA预处理,可以消除热灭活菌DNA的干扰,实现对活菌的定量检测。

PMA-qPCR定量检测畜禽肉类中沙门菌活菌的研究

目的将叠氮溴化丙锭(PMA)与实时荧光定量聚合酶链反应(q PCR)相结合定量检测畜禽肉类中活的沙门菌。方法通过优化光反应时间、PMA浓度等PMA作用条件,建立PMA-q PCR方法,构建重组质粒建立标准曲线,考察该方法的灵敏性、特异性,并将该方法用于定量检测未经增菌培养的畜禽肉类样品中的沙门菌。结果在PMA浓度为15μg/m L、曝光5 min的条件下可完全抑制样品中死菌DNA的扩增。建立的定量标准曲线循环阈值(Ct值)与质粒标准品模板的拷贝数呈良好线性关系(r2=0.997 9),最低可检出10拷贝/反应体系。所建立的PMAq PCR方法最低可检出21拷贝/μL沙门菌。采用PMA-q PCR检测人工染菌鸡肉样品,最低可检出103CFU/m L沙门菌。结论用PMA-q PCR方法可实现定量检测畜禽肉类样品中活的沙门菌,从而达到快速检测的目的。

完善根管充填后治疗失败感染根管中粪肠球菌的活菌研究

目的:将叠氮溴化丙锭(PMA)与定量PCR(q PCR)技术结合,用于计算根管治疗失败感染根管中粪肠球菌活菌数量。方法:选取34名根管治疗失败患者,提取感染根管内细菌DNA,每个样本分成2份,一份经PMA处理(实验组),一份未用PMA处理(对照组),然后通过q PCR方法检测样本中粪肠球菌的活菌数量和细菌总量。结果:20例患者(58.8%)细菌样本中检测出粪肠球菌。实验组和对照组Ct值分别为25.12±2.04和24.62±2.02(P=0.001)。结论:对于根管治疗失败感染根管内活菌的研究使用PMA结合定量PCR可能是一种有效的方法。

肉及肉制品中沙门氏菌活细胞的PCR检测研究

将荧光染料叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)与普通聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)结合,通过对PMA的曝光时间、浓度进行优化,确定PMA-PCR区别死活细胞的最佳条件,并制作活细胞定量标准曲线,建立肉及肉制品中沙门氏菌活细胞的PMA-PCR检测方法。结果表明:使插入死细胞DNA中的PMA活化并且光解溶液中游离PMA的最佳曝光时间为15min;不抑制沙门氏菌活细胞DNA扩增的最大PMA质量浓度为10μg/mL;完全抑制热致死细胞DNA扩增的最小PMA质量浓度为4μg/mL。经PMA处理,含有不同比例的沙门氏菌热致死细胞和活细胞的混合液中活的沙门氏菌能够通过PCR被选择性的检测,最小检测限为20CFU/PCR。而且,经研究发现在20～2×105CFU/PCR范围内,电泳条带相对荧光强度与活细胞数的对数具有线性关系。采集30份肉及肉制品样品,利用PMA-PCR方法检测出两份生肉样品中存在沙门氏菌,经过6h的富集培养后的活菌浓度分别为2.5×103CFU/mL和3.4×103CFU/mL。

纳米银对多菌种生物膜中粪肠球菌的杀菌作用

目的:研究纳米银对多菌种生物膜中粪肠球菌的杀菌作用。方法:用粪肠球菌、产黑色素普雷沃菌以及具核梭杆菌构建多菌种生物膜85个。分别用0.1%(12~15 nm、100 nm)纳米银悬浊液以及2%的次氯酸钠溶液处理,然后通过qPCR方法检测样本中粪肠球菌的活菌量和粪肠球菌的细菌总量。配对t检验比较各组细菌样本临界循环数(Ct)。结果:各个实验组使用和不使用PMA之间粪肠球菌的细菌计数有着差别(P=0.000);将3个实验组使用和不使用PMA q PCR检测到的Ct值的差值进行比较:纳米银(12~15 nm)实验组最大,纳米银(100 nm)实验组次之,次氯酸钠实验组最小(P<0.05)。结论:纳米银对于多菌种生物膜中的粪肠球菌有着较强的杀菌作用,直径较小的纳米银杀菌作用较强。

改良单叠氮丙啶-荧光定量PCR法的建立及其检测抗结核药物活性的价值

目的建立改良单叠氮丙啶(propidium monoazide xx,PMAxx)-荧光定量PCR(qPCR)鉴定MTB活菌和热灭活菌的方法,并探讨PMAxx-qPCR进行抗结核药物体外活性检测的价值。方法通过活菌和热灭活菌优化PMAxx针对MTB菌株H37Rv的预处理条件,包括曝光时间、暗孵育时间、PMAxx浓度,以及靶标DNA片段长度等。通过绘制量效曲线和建立循环阈值(Cq)与菌负荷的标准曲线,应用PMAxx-qPCR法计算测定异烟肼(INH)、利福平(RFP)的体外抗菌活性,评价检测敏感度,并分别与微孔板Alamar Blue(MABA)法和菌落形成单位(CFU)计数法进行比较,菌落计数采用独立样本t检验进行统计分析,以P<0.05为差异有统计学意义。结果当细菌负荷设定为107 CFU/ml时,在PMAxx浓度为10μmol/L、暗孵育10 min后曝光15 min可有效鉴别活菌、死菌(△Cq死-活=6.772±0.453),且使用>200 bp靶标片段可更有效地反映活菌、死菌的差异。PMAxx-qPCR方法在药物作用后3d可获得与MABA法一致性良好的最低抑菌浓度(MIC)检测结果(INH:0.049~0.076μg/ml与0.032~0.064μg/ml,t=0.782,P=0.491;RFP:0.102~0.145μg/ml与0.051~0.079μg/ml,t=2.828,P=0.066)。定量标准曲线Cq与菌计数(lgCFU/ml)呈良好的线性关系(R2=0.9863),最低检测限为102 CFU/ml,且PMAxx-qPCR方法和CFU计数方法测算16×MIC、8×MIC、4×MIC、2×MIC和1×MIC浓度的INH的抗菌计数分别为(4.376±0.344)和(4.325±0.318)、(4.232±0.106)和(3.936±0.194)、(4.122±0.277)和(3.874±0.105)、(3.950±0.113)和(3.675±0.250)、(3.770±0.228)和(3.618±0.257)CFU/ml,两种方法计数比较差异均无统计学意义(t值分别为0.165、1.894、1.186、1.419和0.626,P值分别为0.880、0.199、0.357、0.292和0.595),而16×MIC、8×MIC、4×MIC、2×MIC和1×MIC浓度的RFP的抗菌计数分别为(4.577±0.216)和(4.675±0.250)、(4.445±0.054)和(4.374±0.675)、(3.627±0.173)和(3.154±0.076)、(1.946±0.359)和(2.159±0.083)、(1.552±0.423)和(0.960±0.202)CFU/ml,两种方法计数比较差异均无统计学意义(t值分别为0.469、0.199、3.535、0.784、1.777,P值分别为0.671、0.855、0.071、0.490、0.174)。结论建立的PMAxx-qPCR方法稳定,可应用于一线抗结核药物INH和RFP的活性检测,敏感度高且快速准确。

叠氮溴化丙锭-qPCR法定量检测植物乳杆菌

目的将叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)与实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qPCR)相结合,建立一种活性植物乳杆菌定量检测的PMA-qPCR方法。方法首先进行引物探针特异性验证,优化PMA反应条件,建立标准曲线,验证灵敏度,然后将该方法用于检测人工添加奶粉、米粉、酸奶样品以及冻干样品中的植物乳杆菌。结果最佳PMA浓度为2μg/mL,最佳曝光时间为10 min,建立的PMA-qPCR方法可以快速、高效、特异地检测植物乳杆菌,利用细菌纯培养物与对应Ct值建立标准曲线,可以看出纯培养物浓度与Ct值之间存在对应线性关系,相关系数(r^(2))为0.9992,最低检测限为15拷贝/反应体系,人工添加样品以及冻干样品检测中PMA-qPCR和平皿计数法结果的对数值进行配对t检验,显示在不同的人工添加样本以及冻干样品中均无显著性差异(P>0.05)。结论本研究建立的PMA-qPCR检测方法能快速、准确、特异、灵敏地定量检测活性植物乳杆菌。

餐饮食品中6病原菌叠氮丙啶-定量聚合酶链反应检测方法开发与检验数据分析

目的建立叠氮丙啶-定量聚合酶链反应法(propidiummonoazide-quantitativepolymerasechain reaction,PMA-qPCR)快速检测餐饮食品中6病原菌的方法。方法开发6种病原菌前增菌通用型培养基,采用热裂解方法提取样品DNA,采用PMA技术鉴别活菌与死菌,运用分子生物学技术检测样品中目标菌的特异性基因片段,建立病原菌的PMA-qPCR检测方法,开展餐饮食品样品病原菌筛查检测。结果本方法特异性良好,灵敏度较高, 1533份餐饮食品样品中检出病原菌71株,检出率为4.63%(71/1533)。结论本研究运用PMA-qPCR开展病原菌活菌检测技术研究,所建立研究方法可广泛应用于餐饮食品及相关食品中病原菌的快速筛查检测,具有较好的应用前景和现实意义。

食品中沙门氏菌活菌的Taq Man实时荧光PCR检测方法研究

利用沙门氏菌fim Y基因设计特异性引物、探针,优化叠氮溴化丙锭(propidium azide bromide,PMA)染料浓度及相关反应条件,使用高亮度蓝色发光二极管(Light Emitting Diode,LED)光解仪代替卤素光源,建立了食品中沙门氏菌活菌的Taq Man实时荧光PCR快速检测方法。实验表明,设计的引物、探针特异性强,能特异性扩增7株沙门氏菌,其他非沙门氏菌均无扩增,对沙门氏菌纯培养物检测灵敏度可达102 CFU/m L。经反应条件优化后,在PMA浓度为20μmol/L,暗反应5 min,曝光反应10 min条件下,对106 CFU/m L的沙门氏菌热致死菌抑制效果最好,活菌的扩增不受影响。利用优化的PMA处理方法结合Taq Man实时荧光PCR和不经PMA处理的Taq Man实时荧光PCR,分别检测3种不同浓度(5 CFU/25 g、50 CFU/25 g、500 CFU/25 g)活菌和高浓度死菌(106 CFU/25 g)的沙门氏菌人工混合污染样品,以及仅高浓度沙门氏菌死菌污染的人工污染样品。结果显示,2种方法检测沙门氏菌活菌和沙门氏菌死菌的人工混合污染样品的结果均为阳性,只添加沙门氏菌死菌的人工污染样品PMA处理组扩增结果为阴性、不经PMA处理对照组为阳性,表明优化后的PMA处理方法排除了沙门氏菌死菌对Taq Man实时荧光PCR假阳性的影响,并可以有效检出食品样品中的沙门氏菌活菌。食品样品增菌后的沙门氏菌活菌检测过程只需4~5 h,本研究为食品中沙门氏菌活菌的快速检测提供了一种科学有效的方法。

副溶血性弧菌PMA-LAMP方法的建立

副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)是一种常见的食源性致病菌,在海鲜等食物中检出率很高,食用没有煮熟的带菌食物或者腌制品,极易引起食物中毒。目前用以检测副溶血性弧菌的快速检测方法都不能区别死活菌,容易出现假阳性结果。本研究基于DNA结合染料叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA),利用荧光染料钙黄绿素(Calcein)的特性,建立了一种实时的可视化环介导等温扩增方法(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP),并与q PCR方法进行比较。实时可视化LAMP方法的反应结果,既可以肉眼直接观测,也可以借助荧光分析设备实时监测,并对半定量分析进行初探,为之后向定量分析深入研究打下基础。实验结果表明,实时可视化PMA-LAMP方法的灵敏度可达5.0×102 CFU/m L,模拟食样灵敏度为1.9×102 CFU/m L,与PMA-q PCR方法结果一致。除去前增菌时间,整个检测过程只需2 h,且准确率高,为副溶血性弧菌快速检测的开展提供了有效的技术支持。

SD-PMA-qPCR快速检测冷冻肉制品中活性沙门氏菌的研究

为实现冷冻肉制品中活性沙门氏菌的快速检测与控制,本文利用PMA(叠氮溴化丙锭)和SD(脱氧胆酸钠)消除死菌和损伤菌的影响,建立了运用SD-PMA-qPCR法检测活性沙门氏菌的反应体系和反应条件,并进行人工染菌样品检测试验。SD的最佳浓度确定为0.1%,最佳孵育时间为20 min。对-20℃低温冷冻处理3~4 d的沙门氏菌处理液,使用平板计数法、qPCR、PMA-qPCR和SD-PMA-qPCR进行计数,结果发现qPCR与PMA-qPCR二者检测值接近且明显高于平板计数值,而SD-PMA-qPCR检测值与平板计数值相近,这表明SD和PMA的联合使用能有效的消除死菌和损伤菌的影响。人工染菌样品试验表明,沙门氏菌检出限在10~2CFU/g,同时10~6 CFU/g大肠杆菌O157:H7的存在不会影响检测结果。本研究所建立的SD-PMA-qPCR检测方法特异性好、灵敏度高,有望成为快速检测冷冻肉制品中活性沙门氏菌的新方法,具有很好的研究价值和应用前景。