叠氮丙啶-实时荧光聚合酶链式反应-高通量测序技术鉴定冷链食品中多种病原菌

目的 应用叠氮丙啶-实时荧光聚合酶链式反应-高通量测序技术鉴定冷链食品中多种病原菌,构建病原菌分子进化树。方法 以冷链食品中的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特氏菌5种病原菌作为研究对象,应用叠氮丙啶-实时荧光聚合酶链式反应技术作为冷链食品中病原菌检测初筛手段,应用微生物培养法以及生化鉴定仪器法进行方法比对与结果验证,运用高通量测序以及分子进化树构建作为冷链食品中所分离病原菌的种属地位确证方法。结果 叠氮丙啶-实时荧光聚合酶链式反应技术成功扩增了冷链食品中生活状态病原菌的特征性核酸片段,排除了死亡细菌以及阴性对照菌的干扰,病原菌检出限可达到1×10^(3)CFU/mL,一次反应可检测42份试样,可以在18 h内完成检测工作。在冷链食品中病原菌抽样检测调查中,随机采集的751份冷链食品,共检出62株病原菌,病原菌总体检出率为8.3%(62/751)。通过后续的16S rRNA测序以及葡萄球菌属、弧菌属以及李斯特菌属分子进化树的构建,成功溯源了金黄色葡萄球菌的污染来源并完成病原菌种属定位。结论 本方法特异性好、灵敏度高、检测通量高,为冷链食品及相关食品中病原菌的精确检测与溯源分析提供新的思路与方法。

基于实时荧光聚合酶链式反应快速检测食源性大肠埃希氏菌O157:H

目的 建立一种快速、灵敏、特异、高效的食源性大肠埃希氏菌O157:H7型实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测方法。方法 针对大肠埃希氏菌O157:H7型的O抗原特异基因rfbE保守区域设计特异性引物和探针,合成基因片段绘制标准曲线,在菌液基因组DNA和质粒双层面调试优化以完成方法的初步建立。其后,对该方法的特异性、敏感性、重复性等进行全面的质量评估验证。结果 该方法特异性100%;基因组DNA检测敏感性为7.11×10^(2)fg/μL;纯培养物水平检测敏感性为1.0×10^(2)CFU/mL;重复性变异系数在0.10%~1.00%之间;标准曲线相关系数r^(2)为0.9994。结论 成功建立了一种性能良好的大肠埃希氏菌O157:H7型实时荧光探针PCR快速检测方法,该方法具有灵敏度高、特异性强、扩增时间短,仅为35 min的特点,可用于疑似大肠埃希氏菌O157:H7型污染样品的快速诊断检测。

PMA-qPCR定量检测畜禽肉类中沙门菌活菌的研究

目的将叠氮溴化丙锭(PMA)与实时荧光定量聚合酶链反应(q PCR)相结合定量检测畜禽肉类中活的沙门菌。方法通过优化光反应时间、PMA浓度等PMA作用条件,建立PMA-q PCR方法,构建重组质粒建立标准曲线,考察该方法的灵敏性、特异性,并将该方法用于定量检测未经增菌培养的畜禽肉类样品中的沙门菌。结果在PMA浓度为15μg/m L、曝光5 min的条件下可完全抑制样品中死菌DNA的扩增。建立的定量标准曲线循环阈值(Ct值)与质粒标准品模板的拷贝数呈良好线性关系(r2=0.997 9),最低可检出10拷贝/反应体系。所建立的PMAq PCR方法最低可检出21拷贝/μL沙门菌。采用PMA-q PCR检测人工染菌鸡肉样品,最低可检出103CFU/m L沙门菌。结论用PMA-q PCR方法可实现定量检测畜禽肉类样品中活的沙门菌,从而达到快速检测的目的。

叠氮溴化丙锭-qPCR法定量检测植物乳杆菌

目的将叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)与实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qPCR)相结合,建立一种活性植物乳杆菌定量检测的PMA-qPCR方法。方法首先进行引物探针特异性验证,优化PMA反应条件,建立标准曲线,验证灵敏度,然后将该方法用于检测人工添加奶粉、米粉、酸奶样品以及冻干样品中的植物乳杆菌。结果最佳PMA浓度为2μg/mL,最佳曝光时间为10 min,建立的PMA-qPCR方法可以快速、高效、特异地检测植物乳杆菌,利用细菌纯培养物与对应Ct值建立标准曲线,可以看出纯培养物浓度与Ct值之间存在对应线性关系,相关系数(r^(2))为0.9992,最低检测限为15拷贝/反应体系,人工添加样品以及冻干样品检测中PMA-qPCR和平皿计数法结果的对数值进行配对t检验,显示在不同的人工添加样本以及冻干样品中均无显著性差异(P>0.05)。结论本研究建立的PMA-qPCR检测方法能快速、准确、特异、灵敏地定量检测活性植物乳杆菌。

实时荧光定量聚合酶链反应技术对结核性脑膜炎的诊断价值分析

目的分析实时荧光定量聚合酶链反应技术对结核性脑膜炎的诊断价值。方法研究将该院2018年1月-2019年6月期间收治的70例结核性脑膜炎患者作为研究对象展开调查,对患者进行随机分组后采取不同的诊断方式,一组应用常规涂片检测方式,一组应用实时荧光定量聚合酶链反应技术,分别作为对照组和实验组,对比两组患者的检测结果及灵敏度、漏诊率和特异度。结果实验组患者检出阳性29例,阳性检出率为82.86%,其数据高于对照组,数据差异有统计学意义(χ^2=20.901,P<0.05);实验组检测的灵敏度为82.86%,漏诊率为17.14%(6例),不存在误诊情况,特异度为100.00%,其灵敏度高于对照组(χ^2=20.901,P<0.05)。结论实时荧光定量聚合酶链反应技术诊断结核性脑膜炎检出率、灵敏度和特异度均比较高,具有一定的指导意义,但仍存在一定的漏诊情况,建议临床中结合多种检查方式联合诊断。

实时荧光定量聚合酶链式反应技术在B族链球菌检测中的应用研究进展

B族链球菌(GBS)是围产期孕妇感染导致新生儿感染致病的主要致病菌之一,可引起新生儿肺炎、败血症、脑膜炎等早期侵入性感染,严重的甚至会导致死亡.本文综述了金标准培养法、快速培养法与实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)法在孕产妇检测GBS阳性率、敏感度和特异度方面的差异,对不同孕周的孕妇采用何种检测方法提出了建议,以期能够在全国范围内普及GBS的筛查和预防,达到降低母婴并发症的目的.