本生烟响应蛋白激发子PevD1的差异表达基因鉴定与分析

【目的】通过RNA-Seq筛选本生烟(Nicotiana benthamiana)响应大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)蛋白激发子PevD1的差异表达基因(differentially expressed gene,DEG),分析PevD1诱导植物产生抗病性的潜在分子机制。【方法】用10μmol·L-1的PevD1蛋白液渗入4周龄的本生烟叶片,分别在处理后6、12和24 h取样提取RNA,构建mRNA文库后采用BGISEQ-500平台进行测序。筛选各时间点的差异表达基因进行GO和KEGG分析;重点分析与诱导抗病相关的富含亮氨酸重复序列类受体蛋白激酶(leucine-rich repeats RLKs,LRR-RLKs)、转录因子(transcription factor,TF)以及病程相关蛋白(pathogenesis related protein,PR蛋白)家族差异表达基因;采用qRT-PCR对差异表达基因进行定量验证。【结果】GO功能富集以及KEGG通路富集分析表明,PevD1诱导6 h后的差异表达基因主要与细胞识别、光合作用、光收割等功能相关,显著富集在光合作用-天线蛋白通路、萜类化合物合成通路、黄酮和黄酮醇等次生代谢产物合成相关通路中;12 h和24 h的差异表达基因主要与细胞识别和胞内激酶等生物学功能相关,显著富集在植物-病原互作通路、倍半萜和三萜生物合成通路、黄酮和黄酮醇生物合成通路、亚麻酸代谢等次生代谢产物合成相关通路中。与光合作用相关的差异表达基因主要呈下调趋势,与萜类、黄酮类等抗病相关次生代谢产物合成通路相关的差异表达基因主要呈上调趋势。PevD1诱导后大量的LRR-RLKs、TF以及PR蛋白家族基因显著上调表达,这些基因与激发子识别、基因转录调控和抗病性相关。经qRT-PCR验证后,所检测基因的表达趋势与转录组测序结果一致。【结论】PevD1诱导本生烟中大量基因转录重排,大量LRR-RLKs、TF和PR蛋白家族基因上调表达,激活了植物免疫系统,使植物产生抗病性。研究结果可为今后深入探讨PevD1诱导植物免疫的机理提供依据。

蛋白激发子PevD1诱导本生烟植保素辣椒醇的产生和积累

诱导抗病性是实现植物病害绿色防控的重要途径,大丽轮枝菌蛋白激发子PevD1能激活植物免疫系统,提高本生烟对烟草花叶病毒(TMV)和烟草野火病病原菌Pseudomonas syringae pv.tabaci、棉花对大丽轮枝菌Verticillium dahliae的抗病性,但分子机制不清晰。前期转录组测序(RNA-Seq)分析结果显示,本生烟响应PevD1诱导的差异表达基因显著富集在倍半萜烯和三萜烯的合成途径中。本文进一步分析了这些差异表达基因的功能,并通过测定倍半萜植保素辣椒醇合成关键基因EAS和EAH的转录表达水平和辣椒醇积累量,证明PevD1能诱导本生烟产生植保素辣椒醇,明确了PevD1诱导植保素辣椒醇的产生是提高植物抗病性的重要机制之一。

大丽轮枝菌蛋白激发子PevD1激活本生烟促分裂原活化蛋白激酶MAPK

激活植物免疫系统、提高植物自身抗性是植物病害绿色防控的重要途径之一。促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)是植物免疫系统的重要防御信号传导途径。为了探讨大丽轮枝菌蛋白激发子PevD1诱导植物广谱抗病性的分子机制,前期利用转录组测序(RNA-Seq)技术获得了本生烟响应PevD1诱导的差异表达基因,其中大量基因显著富集在MAPK通路上。本研究对这些差异表达基因进行了功能分类并进一步分析,发现这些基因涉及的功能十分广泛,包括参与植物识别的蛋白激酶(LRR-RLK)、调控基因表达的转录因子家族(WRKY和ERF)、与抗病相关的几丁质酶基因、参与钙离子信号传递的钙调蛋白(Calmodulin)、调控活性氧(Reactive oxygen species,ROS)产生的呼吸爆发氧化酶(Rboh)和清除ROS的过氧化氢酶(Catalase)等。从富集在MAPK通路中的差异表达基因中选出10个基因进行了qPCR验证,转录表达模式与转录组测序结果一致。用特异性磷酸化位点抗体杂交技术验证了PevD1激活了本生烟的MAPK,即水杨酸诱导的蛋白激酶SIPK和伤诱导的WIPK被激活。

真菌蛋白激发子PevD1互作蛋白的酵母双杂交筛选及融合蛋白的原核表达

PevD1是大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)发酵液中分离纯化的一种新蛋白激发子,能激发烟草和棉花的免疫防御反应,提高抗病性。旨在深入研究PevD1的作用机理,利用酵母双杂交系统,以PevD1为诱饵蛋白,筛选拟南芥中PevD1的互作蛋白,经复筛、回转验证得到3个候选互作蛋白基因R1,R2和R4。利用同源克隆技术获得烟草中互作蛋白编码基因NR1、NR2和NR4;经酵母双杂交验证其中的NR2蛋白能与PevD1特异性结合。利用原核表达系统,成功构建了重组表达载体pMAL-C2XNR2并转化大肠杆菌细胞,经IPTG诱导获得了可溶性表达的NR2融合蛋白。

大丽轮枝菌蛋白激发子PevD1诱导棉花抗病性及作用机理

PevD1是一种大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)分泌蛋白,具有激发烟草过敏反应(HR)和系统获得性抗病(SAR)的功能。为明确蛋白PevD1诱导棉花抗病性及其作用机制,本文利用大肠杆菌表达、纯化的PevD1诱导棉苗植株,检测棉苗对大丽轮枝菌的抗性及免疫应答反应。结果表明,大肠杆菌表达的PevD1重组蛋白不是棉花品种"新陆早42号"的致萎因子,叶片注射8μg/mL PevD1蛋白诱导3 d后根部接种大丽轮枝菌,15 d后PevD1处理组病害减轻率达35.04%。PevD1能诱导棉花叶片抗性早期信号分子H_2O_2产生和NO积累,维管束细胞壁加厚、木质素和酚类物质的积累。另外,PevD1处理能提高防御酶PAL、POD和PPO活性,提高棉花抗性基因和木质素合成相关基因PAL、C4H1、4CL的转录水平。说明PevD1通过激发棉花免疫系统而提高抗病性,该研究不仅为利用PevD1蛋白激发子控制棉花黄萎病提供了科学依据,同时也为阐明棉花与大丽轮枝菌互作机理提供了理论基础。

互作蛋白Nbnrp1参与真菌蛋白激发子PevD1诱导烟草抗病性的功能研究

Pev D1是大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)分泌的蛋白激发子,能引起烟草细胞坏死、免疫防御反应和系统抗病性。本实验室前期鉴定了Pev D1的一个互作蛋白Nbnrp1,本研究在此基础上,分析了Nbnrp1在烟草中的表达特征及其亚细胞定位。用RNAi技术获得了Nbnrp1基因沉默株,研究了互作蛋白Nbnrp1在Pev D1诱导烟草抗病性中的功能。结果表明,Nbnrp1在烟草根、茎和叶以及不同生长发育阶段均有表达,定位在烟草细胞核和细胞质中。与野生型植株比较,Nbnrp1沉默植株对Pev D1诱导的细胞坏死反应的程度降低,抗病性减弱,抗病基因PR1-a,PR1-b转录表达水平降低,说明Nbnrp1蛋白参与了蛋白激发子Pev D1诱导的烟草免疫反应和系统抗病性。研究结果为进一步揭示Pev D1诱导烟草抗病机制以及大丽轮枝菌与寄主互作机制奠定了基础。