枳PtrPP2C51基因克隆与非生物胁迫表达分析

克隆枳PP2C基因家族的PtrPP2C51基因,分析其在低温、高温和干旱等胁迫下的表达规律,探究其在非生物胁迫中的功能。以1年生枳苗为试材,从嫩叶克隆到PtrPP2C51基因cDNA序列,采用生物信息学方法对其进行分析,利用实时荧光定量PCR仪(qRT-PCR)检测枳苗在低温、高温和干旱(15%PEG-6000)处理下的PtrPP2C51基因表达模式。克隆获得PtrPP2C51基因编码区CDS序列长度为879 bp,编码292个氨基酸,其蛋白分子量为31.36 ku,理论等电点4.9,脂肪系数79.52,不稳定系数39.57,亲水性平均值-0.279。PtrPP2C51蛋白的二级结构中α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲占比分别为40.07%、7.88%、18.15%和33.90%。PtrPP2C51蛋白与克里曼丁橘的PP2C蛋白在同一小分支上,亲缘关系最近。经低温(0℃)、高温(38℃)和干旱(15%PEG-6000)3种不同胁迫处理,PtrPP2C51基因的相对表达量均表现持续上调趋势,并且均在处理12 h时表达量达到最高值。PtrPP2C51基因可能参与枳的抗逆胁迫调控机制。

木薯MePP2CAb基因克隆及表达分析

2C型蛋白磷酸酶(protein phosphatase 2C,PP2C)在ABA核心信号途径中发挥着重要作用。为了研究PP2C基因在木薯响应非生物胁迫过程中的功能,本研究通过RT-PCR技术,从木薯Arg7中克隆得到MePP2CAb基因,并对其进行生物信息学分析、自激活活性分析、启动子活性分析及不同逆境和激素处理下的表达模式分析。结果表明:(1)MePP2CAb基因的长度为1296 bp,包含431个氨基酸残基,蛋白相对分子量和理论等电点分别为47.08 kDa和5.5,具有PP2C家族的结构域特征。蛋白质序列比对结果显示,MePP2CAb与橡胶树和麻风树的PP2C序列最为相似,一致性分别为82.75%和74.01%,在C-端保守。上述结果证明MePP2CAb基因属于PP2C家族。(2)MePP2CAb基因在木薯块根中的表达最高。(3)MePP2CAb具有一定的自激活活性,MePP2CAb基因的全长启动子的活性也较高。(4)MePP2CAb基因属于ABA核心通路,启动子序列分析显示,它包含ABRE(abscisic acid responsiveness)元件、MeJA响应原件、干旱诱导元件(drought-induced motif)等元件。不同逆境和激素处理的结果也表明,MePP2CAb基因在冷处理和SA处理下受到抑制,在NaCl、mannitiol、ABA和MeJA处理的过程中受到诱导。另外酵母双杂交结果显示MePP2CAb能够与MePYL1产生互作。根据上述结果推测,MePP2CAb基因可能对木薯的非生物胁迫有响应,但其到底是正调控因子还是负调控因子尚不清楚。该结果为进一步研究解析MePP2CAb基因在ABA信号通路中的作用及提高木薯在非生物胁迫中的适应能力提供参考。

辣椒PP2C家族基因鉴定与响应低温胁迫的表达分析

对辣椒PP2C基因家族成员进行全基因组鉴定和特征分析,并研究CaPP2Cs基因在低温胁迫下的表达模式,结果表明:在辣椒参考基因组共系统鉴定出99个CaPP2Cs基因家族成员,并不均匀地分布在12条染色体上,CaPP2Cs基因编码的氨基酸数介于99~1 572 aa,分子量介于10.94~178.40 Da,等电点介于4.08~9.51。系统进化树分析可将辣椒和拟南芥的PP2C基因分为13个亚族,每个亚族均含有辣椒PP2C基因,基因结构分析表明CaPP2Cs基因的外显子数量介于1~18;在CaPP2Cs基因的启动子中发现许多与光、低温和激素响应有关的顺式作用元件。转录组数据分析表明,CaPP2C31基因在叶片中的表达量显著高于其他基因,CaPP2C16则特异性地表达于授粉后50 d的胎座中。低温处理24 h时,CaPP2C97和CaPP2C3在叶片中呈现显著的下调表达;低温处理1 h时,CaPP2C36、CaPP2C5、CaPP2C53、CaPP2C43、CaPP2C99等基因在根中明显上调,CaPP2C19、CaPP2C23、CaPP2C44、CaPP2C95则显著下调,表明CaPP2Cs可能在辣椒响应低温胁迫中发挥作用。

谷子PP2C基因家族的特性

PP2Cs(2C type protein phosphatases)是一种单体丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶,在真核生物中,PP2Cs在脱落酸(ABA)、茉莉酸(JA)、水杨酸(SA)等激素信号传导途径中起着重要的调控作用。本研究通过序列比对,从谷子基因组中筛选出80个PP2C候选基因,聚类分析将其分为12个亚族(A、B、C、D、E1、E2、F1、F2、G、H、I、J)。与拟南芥PP2C基因家族比对表明,A^I为2个物种共有的亚族,J亚族只存在于谷子基因组中,L亚族只存在于拟南芥中。将谷子A亚族的10个成员命名为SiPP2CA1-10。基因表达谱分析表明,A亚族基因不同程度受ABA、干旱、高盐、低温和低氮诱导表达,其中,SiPP2CA6、SiPP2CA8在5种处理下诱导表达量都高。对10个A亚族成员的启动子分析发现,在这些基因的启动子序列中含有多种参与逆境胁迫应答的顺式作用元件,其中,SiPP2CA5、SiPP2CA6、SiPP2CA7、SiPP2CA8的启动子中含有参与低氮胁迫响应的元件。进一步研究发现,SiPP2CA8主要在根部表达,且在低氮胁迫下一直有较高的表达水平。亚细胞定位结果显示SiPP2CA8定位在细胞膜、细胞质、细胞核中;双分子荧光互补试验(BiFC)结果表明,SiPP2CA8与一个ABA受体类似蛋白SiRCAR3(基因号为Si018317m.g)在细胞膜、细胞质及细胞核上互作,表明SiPP2CA8在谷子中可能参与ABA信号传导过程。

玉米2C型丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(PP2C)活性与耐旱性的关系

在先期研究的基础上,结合运用电子克隆和反转录PCR技术克隆玉米PP2C基因的全长cDNA序列,再分别应用实时荧光定量PCR和非放射性标记法,测定干旱胁迫条件下耐旱性不同的自交系PP2C基因的mRNA表达差异和酶活性差异,以探讨PP2C酶活性与玉米耐旱性的关系。结果表明,我们克隆的全长cDNA序列为玉米PP2C基因家族的新成员,开放阅读框长1164bp,编码388个氨基酸残基。将这一基因命名为ZmPP2Ca,GenBank注册号为EF195257。在干旱胁迫条件下,该基因在耐旱自交系中下调表达,使PP2C酶活性降低;在不耐旱自交系中上调表达,使PP2C酶活性升高。ZmPP2Ca基因的差异表达以及由此引起的PP2C酶活性差异,可能与干旱胁迫条件下玉米细胞的信号传导有关。

欧美杨PdPP2C基因的克隆与功能分析

欧美杨是中纬度地区最适合的短轮伐期工业用材集约经营树种之一,然而盐渍、干旱和低温严重影响了欧美杨的生长发育和产量。本文利用RT-PCR等技术克隆出欧美杨PP2C基因并进行了序列分析。Pd PP2C基因开放阅读框为1 320 bp,编码439个氨基酸。蛋白质序列分析表明,PP2C蛋白N端保守性不强,C端有保守的蛋白磷酸酶区域。荧光定量PCR分析表明,该基因在欧美杨根、成熟叶、顶端叶和茎中都有表达且根中表达量最高。逆境胁迫分析表明,该基因受Na Cl、ABA和干旱等诱导表达。干旱和盐胁迫处理下转Pd PP2C基因拟南芥与野生型相比生长受到较少抑制,且叶绿素含量上升,丙二醛含量下降,表明Pd PP2C基因作为一种蛋白磷酸酶提高了拟南芥的抗逆性。

耐盐杜梨蛋白磷酸酶基因PbPP2C的克隆及表达分析

2C型丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(PP2C)是植物体内脱落酸ABA信号传导关键负调控酶,在植物耐非生物胁迫中发挥着重要的作用。本研究利用RT-PCR技术,克隆出编码杜梨PP2C蛋白的基因Pb PP2C,其核苷酸序列全长1 353 bp,开放阅读框长1 263 bp,编码422个氨基酸残基,这些残基中包括了与二价金属离子结合的MED、DGH、DG和D结构域。系统发生分析结果表明,该氨基酸与拟南芥AHG3亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析结果表明:盐胁迫条件下,Pb PP2C基因在根、茎、叶中的表达12 h达到峰值,同时在根中72 h达到第二个峰值;干旱胁迫条件下,Pb PP2C基因在根、茎、叶中表达72 h达到峰值。说明Pb PP2C与杜梨耐盐和耐干旱胁迫存在紧密关联。

刚毛柽柳ThPP2C基因的克隆和表达分析

蛋白磷酸酶2C(PP2C)是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶,在体内以单体形式存在,由它催化的可逆磷酸化反应是细胞信号转导的重要组成部分,这一过程几乎参与所有的生理和病理过程。本研究从柽柳中克隆获得一条PP2C基因,命名为ThPP2C。该基因开放读码框(ORF)长849 bp,编码282氨基酸,推测蛋白质分子量为30.54 kDa,理论等电点为7.13。qRT-PCR结果显示,0.4 mol·L^(-1)NaCl、20%(w/v)PEG6000、150μmol·L^(-1)ABA和100μmol·L^(-1)JA胁迫处理后,ThPP2C基因在刚毛柽柳根和叶中的表达均发生了明显改变,但时空表达模式不完全相同。NaCl、ABA和JA处理后ThPP2C基因在叶中都表现为下调表达。而根中,NaCl和JA胁迫后主要表现为上调表达。ABA处理早期表达下调,随后表达量逐渐增加。与其他3种胁迫不同的是,PEG6000处理后ThPP2C基因在根中明显下调,而在叶中胁迫早期表现不明显,48 h后被高度诱导。表明ThPP2C基因可能参与了刚毛柽柳高盐、干旱以及激素处理的适应过程,但其功能还有待进一步验证。

小麦TaPP2C59基因的克隆及表达分析

2C型蛋白磷酸酶(PP2C)是ABA信号途径的关键组分,在ABA信号转导及植物对非生物逆境胁迫的应答过程中发挥着重要作用。为给TaPP2C59基因功能的研究奠定基础,同时为小麦对非生物胁迫应答的信号转导机理研究提供参考,本研究从小麦中克隆了第一个PP2C基因TaPP2C59,并对其在逆境胁迫以及多种信号分子处理下的表达模式进行研究。序列分析表明,该基因开放阅读框(ORF)为855bp,编码284个氨基酸。进化树分析表明,该基因编码的蛋白与水稻OsPP2C45蛋白和拟南芥AtPP2C59蛋白的亲缘关系最近。多序列比对分析表明,TaPP2C59具有PP2C家族蛋白的保守结构特征。实时荧光定量PCR分析表明,该基因的表达显著受ABA、低温和高盐胁迫抑制。因此,可以推测TaPP2C59可能作为负调控因子参与ABA信号及非生物逆境胁迫应答。

短柄草2C型蛋白磷酸酶基因BdPP2C2的克隆及表达分析

从短柄草中克隆获得一个2C型蛋白磷酸酶基因,命名为BdPP2C2。序列分析结果表明,该基因ORF的长度为1 368 bp。进化分析结果表明,该基因所编码的蛋白与拟南芥AtPP2C56的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析结果表明,该基因的表达显著受ABA、乙烯、双氧水3种信号分子诱导,并且受高盐和低温胁迫诱导。这些结果表明,BdPP2C2是非生物逆境胁迫中的一个应答因子,并且可能受相关信号分子调控。

二穗短柄草2C型蛋白磷酸基因BdPP2C1的克隆及表达分析

从二穗短柄草中扩增得到一个2C型蛋白磷酸酶基因,命名为BdPP2C1。BdPP2C1与拟南芥中PP2C家族进行系统进化分析,结果表明,BdPP2C1与拟南芥A类PP2C家族成员的亲缘关系较近。利用实时荧光定量PCR表达分析系统,分析在非生物逆境胁迫及相关信号分子处理下BdPP2C1基因的表达情况。结果表明:该基因的表达受脱落酸(ABA)和双氧水抑制,并且受渗透和低温胁迫诱导。因此,BdPP2C1是非生物逆境胁迫中的一个应答因子,并且可能受相关信号分子调控。

拟南芥蛋白磷酸酶PP2C31的盐胁迫响应功能研究

蛋白磷酸酶2C(protein phosphatase 2C,PP2Cs)家族是植物细胞去除磷酸化蛋白中磷酸基团的重要蛋白磷酸酶。拟南芥含有80多个编码PP2Cs的基因,然而大部分成员在植物抗逆反应中的功能仍有待研究。本文发现拟南芥PP2C31(At2g40860)基因的表达受高盐抑制,其T-DNA插入突变体(pp2c31-1突变体和pp2c31-2突变体)表现出对高盐胁迫的耐受性且Na+含量较低。实时定量PCR(quantitative real time-PCR,qRT-PCR)分析发现,PP2C31基因在植物体各组织均有表达;亚细胞定位结果显示PP2C31蛋白定位于细胞质和细胞核中。利用脱落酸合成抑制剂和外源脱落酸处理发现,突变体植株的高盐耐受性和PP2C31基因的表达均不受脱落酸的影响。研究结果表明:PP2C31蛋白是拟南芥响应高盐胁迫的一个非脱落酸依赖的负调控组分。

植物PP2C蛋白磷酸酶负调控ABA信号转导途径研究进展

PP2C(PP2C-type protein phosphatases)蛋白磷酸酶是一类丝氨酸/苏氨酸残基蛋白磷酸酶,植物体内目前已经发现了4种PP2C蛋白磷酸酶:ABI,AtP2C-HAB1,AtPP2CA以及MP2C。大量的研究表明植物PP2C蛋白磷酸酶参与了ABA信号转导途径的负调控功能。就高等植物PP2C的分类及其对ABA信号转导途径的负调控功能的研究进展进行了综述。

PP2C蛋白磷酸酶调控的细胞信号通路研究进展

2C类蛋白磷酸酶是蛋白磷酸酶家族的重要成员,可以对丝/苏氨酸残基特异性脱磷酸。近来研究表明,2C类蛋白磷酸酶控制着大量关键的细胞功能,如增殖、细胞周期阻滞、衰老和细胞程序性死亡、凋亡和自噬等,因而在介导机体免疫反应、衰老、神经发育及肿瘤发生发展中发挥重要的生物学作用。总结PP2C基因各亚型参与介导的重要细胞信号通路,如丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶(PI3K/AKT)、转化生长因子-β(TGF-β)/Smads、核转录因子-κB(NF-κB)及DNA损伤应答通路,以期为阐明上述生理病理过程的分子基础和调控机制提供新的思路。

PP2C相关基因在砂梨休眠进程中的表达分析

对植物蛋白磷酸酶2C(PP2C)相关基因在砂梨Pyrus pyrifolia品系休眠进程中的表达进行分析。结果表明,砂梨PP2C相关基因与李属PP2C基因高度同源。在梨花芽休眠过程中不同PP2C基因调控的作用不同,PP2C-37-1、PP2C-37-2、PP2C-51-1、PP2C-24四个基因与内休眠调控有关,而PP2C-78对于内休眠的解除则有明显作用。PP2C蛋白磷酸酶相关基因注释到植物激素信号转导途径显示,ABA受体PYR/PYL蛋白与PP2C蛋白以及Sn RK2(蛋白激酶)蛋白形成ABA信号转导的复合物可以作用于转录因子ABF从而调控梨花芽的休眠。

蛋白磷酸酶2C(PP2C)的表达、纯化与催化活性

从小鼠肌肉组织中提取了总RNA,经RT-PCR,扩增出蛋白磷酸酶2C(PP2C)基因,并构建了pUCm-T载体.经核酸序列分析证明PP2C基因序列正确后,将pUCm-T中的PP2C基因插入pET28a载体中,构建了表达载体pET28a-PP2C,并转化到E.coli BL21(DE3)进行表达.经测定,该菌株表达目的蛋白PP2C的最适条件为:诱导物IPTG的终浓度为0.8 mmol/L,37℃,诱导时间为20 h.在此条件下,PP2C实现了高效表达,表达的PP2C蛋白约占菌体总蛋白的18.2%,其中在裂解上清液、沉淀中分别占总蛋白的7.1%和11.1%.经SDS-PAGE分析,表达产物分子量约为42 000.应用Ni-NTA柱实现了可溶性PP2C的纯化,收率达80.5%,纯化的PP2C比活力达34.5 U/mg.

烟草PP2C家族基因降雨量响应表达模式分析

PP2C是一类单体丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶,广泛参与生物体内多个信号转导。PP2C基因家族的鉴定和功能研究已在多种作物上报道。为探明不同降雨量条件下烟草PP2C基因家族表达特征,通过塑料大棚内模拟人工定量喷灌试验和不同降雨量的田间试验,利用RNA-Seq技术对移栽后40和60d烟叶中PP2C家族基因进行了表达分析。结果显示,18个烟草PP2C家族基因的表达明显受降雨量影响,可分成9个亚族。其中6个PP2C家族成员的表达随着降雨量增大而降低,4个PP2C家族成员的表达随着降雨量增大而升高。本研究初步探明了云烟87中受降雨量影响的PP2C基因家族种类及其表达特点,为抗旱育种和抗旱栽培提供参考。

枳PP2C基因家族的鉴定及表达分析

【目的】鉴定枳(Poncirus trifoliata)PP2C基因家族,并分析其在不同组织的表达模式以及对低温、高温和干旱胁迫的响应。【方法】利用生物信息学方法在枳基因组中鉴定PP2C基因家族,分析其理化性质、染色体定位、系统进化、基因结构、保守基序、基因复制及启动子顺式作用元件等,并采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)方法检测PtrPP2C基因家族成员在不同非生物胁迫处理下的表达情况。【结果】枳中共鉴定出可聚类为10个亚族的53个PP2C基因,命名为PtrPP2C1~PtrPP2C53,其编码蛋白的氨基酸数介于235~1184 aa之间,分子质量为25.90~127.95 ku;这些基因分布于枳的10条染色体上,均具有保守的PP2C蛋白结构域。PtrPP2Cs启动子上存在大量的植物激素、胁迫响应以及生长发育相关的顺式作用元件。转录组数据分析结果显示,不同组织中PtrPP2Cs的相对表达量存在明显差异,总体上分为特异性表达和普遍性表达。qRT-PCR结果显示,在低温、高温和干旱胁迫处理条件下的12 h内,与对照相比分别有10、8和9个基因均持续上调表达;其中,PtrPP2C29较明显,其在(4±1)℃低温处理下的相对表达量是对照的56.8倍,在(38.0±0.5)℃高温处理下的相对表达量与对照相比显著上调,是对照的195.1倍,在干旱处理条件下的相对表达量是对照的5.1倍。【结论】从枳基因组中鉴定出53个PP2C基因家族成员,具有明显的组织表达特异性,并参与多种非生物胁迫应答。研究结果为进一步探究枳PP2C基因家族提供了参考。

巴西橡胶树6个PP2C家族基因成员分子信息学与抗旱功能分析

PP2C是一类丝氨酸/苏氨酸残基蛋白磷酸酶,在高等植物ABA信号途径中起着重要的作用。为阐明巴西橡胶树中PP2C基因的结构与功能,本研究通过生物信息学方法,从橡胶树转录组数据库中鉴定并获得6个PP2C家族基因,均含有PP2CD、F1和F2亚族。通过qRT-PCR技术对6个PP2C家族基因进行了干旱处理下的差异表达分析,发现6个基因都不同程度上响应橡胶树干旱胁迫。本研究为探究PP2C基因在橡胶树抗干旱反应机制提供了理论依据。

棕榈酸激活人脐静脉内皮细胞PP2C降低eNOS Ser1177的磷酸化

目的探讨棕榈酸(PA)激活人脐静脉内皮细胞(HUVEC)蛋白磷酸酶2C(PP2C)对内皮一氧化氮合酶第1177位丝氨酸(eNOS Ser1177)磷酸化的调控作用。方法HUVEC随机分为对照组、PA组、特异性PP2C抑制剂血根碱(San)联合PA组以及转染PP2Cα特异性小干扰RNA(siRNA)组。采用Western blot法检测eNOS总蛋白、eNOS Ser1177磷酸化水平和PP2Cα蛋白水平,二氨基荧光素-FM二乙酸酯(DAF-FM DA)负载法检测细胞内一氧化氮(NO)含量,免疫共沉淀法观察eNOS与PP2C之间的共定位关系。结果与对照组相比,PA处理组eNOS Ser1177磷酸化水平及NO含量均降低,San预处理组可逆转以上变化。敲低PP2Cα蛋白表达水平后,eNOS Ser1177磷酸化水平增加。eNOS与PP2C在细胞内共定位。结论PA通过激活HUVEC的PP2C引起eNOS Ser1177磷酸化水平降低。