柱花草叶肉原生质体提取与瞬时表达体系构建

柱花草(Stylosanthes guianensis)是一种重要的热区豆科牧草,为利用原生质体瞬时表达体系开展柱花草基因功能研究,以20 d龄期‘热研5号’柱花草子叶为试验材料,通过正交试验考察不同因素对原生质体分离及转化效率的影响。结果表明:采用1.5%纤维素酶、1.25%离析酶、0.5 mol·L^(-1)甘露醇和4 mmol·L^(-1)MES酶解液组合,酶解时间为16 h时,原生质体的产量和活性均达到最佳,分别为(4.567×10^(6))个·g^(-1)和92.271%;原生质体浓度为(6×10^(5))个·mL^(-1)、质粒浓度为0.6μg·μL^(-1),PEG-4000浓度为50%、转化时间为5 min时,转化效率最高,可达52.524%。构建了目标蛋白SgRKL1表达载体pA7-BIUTNT::SgRKL1-GFP,利用PEG介导法将其转入柱花草原生质体,激光扫描共聚焦显微镜检测结果显示SgRKL1蛋白定位于细胞膜上,说明所建立的柱花草叶肉原生质体瞬时表达体系可应用于目标基因的瞬时表达和亚细胞定位研究。

响应面法优化六妹羊肚菌原生质体的制备条件

为获得高产、优质的六妹羊肚菌原生质体,以其菌丝为试验材料,运用单因素试验和响应面优化试验,探究原生质体的最佳制备条件。以原生质体产量为考察指标,根据酶解时间、酶质量分数、酶解温度和稳渗剂种类4个单因素的试验结果,运用Box-Behnken设计响应面优化试验,结果表明,在酶解时间3.23 h、酶质量分数2.28%、酶解温度30.26℃条件下,以甘露醇为稳渗剂,六妹羊肚菌原生质体产量可达5.07×10^(5)个/mL,验证试验(实际试验选取酶解时间、酶质量分数、酶解温度分别为3.2 h、2.3%、30℃)所得原生质体产量为(5.13±0.13)×10^(5)个/mL,两者差异不显著。对于六妹羊肚菌原生质体的制备,各因素的影响程度:酶解时间>酶质量分数>酶解温度,酶质量分数与酶解温度的交互作用有极显著影响(P<0.01),酶解时间与酶解温度的交互作用有显著影响(P<0.05)。

基于响应面法大球盖菇原生质体制备条件优化

以大球盖菇菌丝体为试材,在单因素试验基础上,以原生质体产量为响应值,采用响应面方法优化其制备条件,研究了大球盖菇原生质体制备最佳条件,以期为后期大球盖菇菌种遗传改良提供参考依据。结果表明:经响应面试验优化后,获得大球盖菇原生质体的最佳制备条件为酶解时间2.5 h、酶解温度32.2℃、菌龄3.8 d,此时获得大球盖菇原生质体产量最大,为35.8×10^(6)CFU·mL^(-1),与理论产量(35.15×10^(6)CFU·mL^(-1))偏差较小。因此,基于响应面法确定的最佳制备条件可获得较高的原生质体产量。

双孢蘑菇原生质体制备条件的优化

采用L16(45)正交分析方法,对双孢蘑菇原生质体制备工艺进行了优化.试验结果表明,最佳制备条件是取菌龄7 d的液体菌丝体,以2.5%溶壁酶+7%蜗牛酶为组合,0.6 mol/L NaCl作为渗透压稳定剂,在30℃条件下,酶解3 h,原生质体产率为2.34×108个/mL.本研究可为双孢蘑菇原生质体的融合及转基因研究提供理论依据.

不同灭活方法在原生质体融合选育米曲霉菌株中应用的研究

实验选取生长速度快的米曲霉菌株AS3.951和产酶活力高的米曲霉菌株CICC2339为对象菌,通过探讨紫外、微波、超声波-热三种不同的物理灭活方法进行米曲霉的原生质体融合,并比较不同方法灭活后进行原生质体融合所得米曲霉融合菌株的性状。结果表明,AS3.951采用紫外灭活、CICC2339采用超声波-热灭活时其融合率最高为6.69%,以此方式筛选得到的融合菌株AC126、AC171产酶能力均高于产酶活力高的亲本菌株CICC2339,且遗传稳定。

烟草种间叶肉原生质体融合方法的研究

利用PEG法、高Ca2+高pH法和PEG-高Ca2+高pH法等三种原生质体融合方法,对普通烟草K326和黄花烟草叶肉原生质体进行融合,结果表明,PEG-高Ca2+高pH法的有效融合率最高,融合效果最好.并同时对影响烟草叶肉原生质体融合的其它因素进行了研究和探讨.

高粱原生质体的制备及转化方法研究

以高粱幼苗为材料,利用1%的纤维素酶Cellulose R10和0.75%的果胶酶Macerozyme R10处理高粱幼茎,对比不同的酶解时间,发现酶解7h原生质体浓度最高、质量最佳。以经过氯化铯密度梯度离心法获得的高纯度质粒对获得的原生质体进行转化,用激光共聚焦进行荧光观察,结果显示,GFP和YFP在全细胞表达。本研究首次建立了高粱以高粱幼茎为材料的原生质体制备及转化体系,其方法简单、高效,可以用于高粱基因功能研究。

番茄灰霉病生防融合子基因组DNA提取方法的研究

以番茄灰霉病生防菌株木霉T-23和链霉菌A的融合子为实验材料,在SDS-CrAB法、改进CTAB法和氯化苄法的基础上加以改进,比较和研究了真菌融合子基因组DNA的提取,找到了一种快速、高效的基因组DNA提取方法,为进一步对融合子进行生防机制和分子生物学水平的研究提供基础。结果表明SDS-CTAB法提取的基因组DNA OD_(260)/OD_(280)为1．909,DNA浓度约为42．0ng/μL,可以满足分子生物学实验的需要。并将提取的基因组DNA直接用于PCR扩增,得到了多态性的RAPD图谱。

枯草芽孢杆菌突变株IA857高效转化方法的研究

【目的】研究比较枯草芽孢杆菌突变株IA857高效转化的最优方法。【方法】以质粒pHCMC04(大小为8089bp)转化突变型枯草芽孢杆菌IA857,分别用电转化法、原生质体法、电击法诱导的原生质体法、Spizizen低盐环境感受态转化法(简称S法)、低盐环境形成饥饿感受态法及其改良方案在其它突变菌株的试验方法(简称C法)进行实验,通过比较优化得出最优转化方法。【结果】采用S法转化枯草芽孢杆菌突变株IA857,质粒加入量为70ng时,转化后直接摇床培养1h转化率最高达到1.2×104 CFU/μg DNA,可以满足枯草芽孢杆菌高效转化的要求。【结论】得出了枯草芽孢杆菌突变株IA857最优转化方法并提出转化枯草芽孢杆菌的基本框架。

不同培养条件对拟南芥根细胞膜片钳记录的影响

本文以沙培养法、蛭石培养法、土培养法、水培养法和MS培养基等不同的方法培养拟南芥(Arabidopsisthaliana),分析了不同培养方法对根生长发育的影响,并分别分离根的原生质体。在膜片钳记录中对不同来源的根原生质体状态进行了比较。结果表明,土培养法分离的原生质体最适于膜片钳记录。

聚乙二醇法诱导烟草原生质体融合的条件优化

采用聚乙二醇(PEG)法诱导烟草原生质体融合,对融合时PEG的浓度、用量、融合时间及融合温度进行优化,以期得到一种融合率较高的方法。结果表明:以40%的PEG融合的二元融合率最高;PEG与原生质体悬浮液体积比为3∶5,在0.5～0.6 mol/L甘露醇为渗透压时,25～30℃下融合20～25 min的融合效果最佳,融合率始终保持在20%左右,甚至可达25%。

以交配型基因为主要标记的香菇菌种鉴定新方法

在香菇交配型基因研究的基础上,提出以交配型基因为主要标记的香菇菌种鉴定新方法。这一方法以香菇性亲合性理论为基础,以交配型基因的等位性和多型性为依据,以标准菌株原生质体单核体的两种亲本交配型为遗传标记,以待测菌株的原生质体单核体为材料。该方法中使用的原生质体方法和交配型测定方法都是相当成熟的技术,操作方便、可靠。

真菌完整染色体DNA的几种不同制备方法

系统地介绍了目前用于真菌电泳核型分析的真菌完整染色体DNA的 7种制备方法 ,并讨论了各种方法在真菌中应用的优缺点 ,为真菌电泳核型分析提供技术基础。

微生物原生质体融合技术研究进展

原生质体融合技术在遗传学、动植物远缘杂交育种、生物学、免疫学、兽医学以及医药、食品、农业等方面都有广泛的应用价值,文章就原生质体制备、再生及其融合过程中的影响因素做了综述,另外还对原生质体融合方法和融合子的筛选方法进行了比较,为选择适宜有效的诱导融合方法和筛选方法提供依据。

霍山石斛原生质体制备条件初探

本实验采用机械法和酶解法对霍山石斛原生质体的分离条件进行研究。结果表明,机械法制备霍山石斛原生质体,得率很低。正交试验法优选出的酶解法最佳组合条件为:纤维素酶1.5%+果胶酶1.5%+离析酶1.0%的酶液组合(溶于0.6mol/L的甘露醇),pH值5.4,28℃温育18 h。

番茄煤霉病生防融合子基因组RAPD分析鉴定

RAPD分子标记以其快速、简便等优点,克服了传统的标记手段和形态分类学的缺点,在亲本和杂交种的鉴别以及在基因克隆与分离和遗传图谱的建立等研究中都起着重要的作用。以番茄煤霉病生防菌株木霉菌T-23和链霉菌A的融合子为实验材料,比较和研究了真菌融合子基因组DNA的提取。并用20个随机引物对亲本及其融合子进行RAPD分析。结果表明,SDS-CTAB法提取的基因组DNAOD260/OD280为1.909,DNA浓度约为42.0 ng/μL,可以满足分子生物学实验的需要;融合子是双亲融合的产物,但从双亲获得的遗传信息不等,融合子在DNA水平上更接近链霉菌。

坛紫菜和拟线形紫菜的原生质体融合及培养

应用PEG 法和电融合法进行了坛紫菜和拟线形紫菜的原生质体融合试验,探讨了PEG 的浓度、处理时间以及洗涤液种类与融合的关系。结果表明,PEG 法的融合率为4.9%～10.2%,电融合率高达32.3%。融合细胞经诱导长成多细胞团的愈伤组织,从愈伤组织上升出小紫菜。

S-3307培养方法和培养基成分对大麦叶肉原生质体培养的影响

试验结果表明:3 ppm S-3307浸种40min可以提高叶肉原生质体的稳定性。培养方法以琼脂糖小块培养法最好,液体浅层培养法次之,看护培养又次之。原生质体的接种密度以0.5～1.0X 106个/ml为好。原生质体进入培养后宜当天即加液。基本培养基KPR优于D2。培养基中添加0.25m tool/L腐胺或lmg/L亚精胺均不利于原生质体的细胞分裂。添加3mg/L IAA可促进细胞分裂,但不能延缓后期细胞死亡进程。添加250mg/L CH略可促进细胞分裂,延缓后期细胞死亡进程。添加1％BSA和lm mol谷胱甘肽可促进细胞分裂并能延缓细胞死亡2～3d,但异常分裂增多。

影响决明无菌苗子叶原生质体分离和培养因素的研究(英文)

以决明(Cassia obtusi folia)无菌苗子叶为材料,对酶组合、无菌苗日龄,植物激素组合和培养方法对其原生质体的分离和培养的影响进行了研究。结果表明:用3％的纤维素酶和0.2％Pectinase Y-23的酶组合处理决明无菌苗子叶块8小时可以高效分离出有活力的原生质体;约14日龄的决明无菌苗子叶比较适合于原生质体的分离;适当浓度的2,4-D 有利于原生质体的分离。促进原生质体分裂的理想的植物激素组合为0.4 mg/L 2,4-D,1.0 mg/L NAA and 0.1 mg/L KT;漂浮培养法最有利于原生质体的分裂和发育。找出了适合于决明无菌苗子叶原生质体的分离和培养的酶组合、植物激索组合、有效培养方法和决明无菌苗子叶日龄。这为有效地从决明无菌苗子叶原生质体再生植株奠定了基础。

香菇交配型基因的遗传研究 Ⅰ一种交配型基因测定的新方法

本文建立了一种香菇交配型基因测定的新方法——原生质单核体系本交配到极性标记法.用这一方法不仅成功地分离和鉴定出不同香菇菌株的四种标准交配型基因,还有效地区分出亲本型和重用型两种交配型基因类型。这一技术为深入开展异宗结合食用菌的遗传研究提供了一个重要的工具。