Construction and primary characterization of Echinococcus multilocularis protoscolex cDNA expression library

Objective To construct a λgt11 cDNA expression library of Echinococcus multilocularis protoscolex isolated in China. Methods Echinococcus multilocularis protoscolex mRNA was extracted using a Quickprep MicromRNA purification kit based on combining of the disruptive and protective properties of guanidinium thiocyanate (GTC) with the speed and selectivity of oligo (dT)-cellulose chromatography in a spum-column with some modification. Purified mRNA (1.8 μg) was submitted to reverse transcription using random hexamers ［pd(N6)］. The double-strand blunt-ended cDNAs were ligated with an EcoRI/NotI adaptor to form a cohesive EcoRI end. Subsequently the synthesized cDNA was inserted into vector λgt11 EcoRI arms. After being packaged in vitro, λgt11 was put to an infectious bacteria Echinococcus coli (E.coli) strain Y1090; the recombinants were screened by color selection. PCR amplification was performed to evaluate the size of insertion DNA fragments.Results The recombinant ratio was nearly 100% and approximately 1×106 clones could be derived from this λgt11 cDNA library. PCR results indicated that the insertion DNAs were about 1.48 kb. Conclusions A λgt11 cDNA expression library consisting of a million recombinant clones has been constructed from Echinococcus multicularis protoscolex mRNA. Further studies on this library are deserved.

细粒棘球绦虫原头蚴、包囊壁和成虫circRNA差异表达分析

旨在解析circRNA在细粒棘球绦虫原头蚴、包囊壁和成虫的表达谱特性,为进一步阐明circRNA分子在细粒棘球绦虫生长发育中的作用提供理论依据。采集细粒棘球绦虫的原头蚴、包囊壁和成虫,提取总RNA,构建circRNA、miRNA以及mRNA文库,采用全转录组测序方法进行测序分析。通过生物信息学分析和功能预测筛选出差异表达的circRNA,并进行GO、KEGG以及ceRNA调控网络分析,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对其进行验证。结果在细粒棘球绦虫原头蚴、包囊壁和成虫共鉴定得到636个circRNA分子,其中差异表达的circRNA分子有140个,在原头蚴、包囊壁和成虫特异性表达的circRNA分子分别为44、2和0个。GO分析结果显示,成虫和原头蚴以及包囊壁相比,差异表达的circRNA分子主要富集于生物学过程的有性生殖、精子发生、雄性配子产生、轴系发生以及神经生成、分化等。KEGG分析结果显示,原头蚴和成虫相比,差异表达的circRNA的显著富集于Notch、三羧酸循环、磷脂酰肌醇、核黄素代谢通路以及脂肪酸合成和降解等信号通路。原头蚴和包囊壁相比,差异表达的circRNA显著富集于背腹轴形成、Notch、wnt以及FoxO信号通路等。成虫和包囊壁相比,差异表达的circRNA的显著富集于Notch、碳代谢、三羧酸循环以及糖酵解/糖异生通路。靶向预测circRNA-miRNA-mRNA调控网络结果显示,有24个差异表达circRNAs与14个miRNAs和54个mRNAs形成164个up-down-up的circRNA-miRNA-mRNA调控网路,有13个差异表达的circRNAs与7个miRNAs以及16个mRNAs构成36个down-up-down的circRNA-miRNA-mRNA调控网络。对部分circRNA分子的qRT-PCR验证结果表明,其mRNA转录水平与测序结果一致。综上所述,本研究首次系统解析了circRNA分子在细粒棘球绦虫原头蚴、包囊壁和成虫的差异表达谱特性,筛选了在原头蚴、包囊壁和成虫各阶段高表达及特异表达的circRNA分子,预测了差异表达circRNA潜在的circRNA-miRNA-mRNA调控网络,为进一步研究circRNA分子在细粒棘球绦虫生长发育中的作用于调控机制奠定了基础。

细粒棘球绦虫原头蚴蛋白表达谱分析

旨在探索细粒棘球绦虫原头蚴蛋白表达特性,揭示在此发育阶段虫体主要的功能蛋白以及信号通路,为揭示虫体的发育调控、筛选疫苗以及药物靶标奠定基础。本试验采用LC-MS/MS技术对虫体原头蚴表达的蛋白质进行研究,然后对获得数据进行GO、KOG以及KEGG等分析;最后采用qRT-PCR和原位杂交技术对鉴定得到的Wnt信号通路的关键基因β-catenin进行了差异表达和组织定位研究。结果显示,本研究共鉴定得到7 172个肽段,1 197个蛋白质,其中包括多个潜在的抗原蛋白质,如四跨膜蛋白超家族、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶、表皮抗原蛋白和烯醇酶等。信号通路分析结果显示其中632个蛋白参与276个调控通路,诸如与虫体发育紧密相关的Wnt、Notch、Hedgehog、NF-κB、cAMP以及胆酸盐信号通路。对β-catenin的验证结果显示,此基因分布于细粒棘球绦虫原头蚴顶突的小刺以及散在的细胞中,同时其相对转录量在体外培养0~10d的过程中呈递减趋势。综上,本研究解析了细粒棘球绦虫原头蚴的蛋白质表达元件,揭示了原头蚴主要的调控信号通路,为虫体的生长发育机制以及包虫病的有效防控提供了理论依据。

X线照射泡球蚴原头节的体外实验研究

目的探讨X线对体外培养的泡球蚴原头节的杀伤作用。方法无菌采集子午沙鼠体内的泡球蚴中含原头节的囊液,将其加入RPMI 1640培养液中培养。原头节体外培养3 d后分装至培养瓶中,每组10瓶,每瓶约含10 000个原头节,设空白对照组、低剂量组(15 Gy和30 Gy)、中剂量组(45 Gy和60 Gy)、高剂量组(75 Gy和90 Gy)、阿苯达唑组(2 500 ng/ml)、45 Gy X线+2 500 ng/ml阿苯达唑组和75 Gy X线+2 500 ng/ml阿苯达唑组。X线照射剂量率为200 cGy/min,源皮距为100 cm。体外培养第4天开始照射,每组共照射3次,每次间隔1 d。首次照射后第1天开始每天取原头节培养液,0.1%伊红染色,光镜下计数每100个原头节中着色原头节数目,每组计算300个原头节的平均死亡率,直至实验组原头节全部死亡为止。同时光镜下观察经X线照射后原头节的变化。结果不同放射剂量组的原头节死亡率与空白对照组间的差异均有统计学意义(P<0.05)。阿苯达唑组原头节死亡率与放射线联合阿苯达唑组间的差异均有统计学意义(P<0.05),且显著高于空白对照组(P<0.05)。其中,X线联合阿苯达唑组与单用X线组原头节死亡率间的差异有统计学意义(P<0.05)。X线照射前原头节饱满、轮廓清晰、结构完整,X线照射后的原头节多呈外翻型,原头节顶突上的小钩排列紊乱,部分脱落,吸盘突起变形,结构塌陷,死亡。结论 X线可在体外杀伤泡球蚴原头节。

阿苯达唑亚砜及其对映体体外抗细粒棘球绦虫原头蚴作用

目的观察阿苯达唑亚砜消旋体(ASOX)、左旋体(L-ASOX)和右旋体(D-ASOX)体外抗细粒棘球绦虫原头蚴作用。方法将细粒棘球绦虫原头蚴随机分为8组(每组约6000个),分别置含6mlDMEM培养液(含15%胎牛血清,青霉素和链霉素各500U/ml)的培养瓶中,ASOX、L-ASOX和D-ASOX的各50μg/ml和100μg/ml组分别加入各药液150μl和300μl(配制液含0.1%二甲基亚砜和0.1%吐温-80的蒸馏水),DMSO组中加入等量配制液,并设空白对照组,每组设2个平行组。每隔1d观察1次,取样滴于玻片,用0.03%美蓝染色,显微镜下计数原头蚴约400个,计算死亡率。直至其中一组的原头蚴全部死亡为止。结果ASOX、L-ASOX和D-ASOX两个浓度(50μg/ml和100μg/ml)组不同作用时间原头蚴的死亡率分别与空白对照组和溶剂组相比,差异均有统计学意义(P<0.01);ASOX组与D-ASOX组相比,差别无统计学意义(P>0.05),而与L-ASOX组相比,差异有统计学意义(P<0.05);D-ASOX与L-ASOX相比,差异有统计学意义(P<0.05)。各药物作用至第9天时,ASOX、L-ASOX、D-ASOX的50μg/ml组原头蚴死亡率分别为(93.6±3.7)%、(56.2±3.9)%和(99.0±1.9)%,各药的100μg/ml组死亡率分别为100%、(74.5±3.7)%和100%,对照组为(19.1±1.3)%,溶剂组为(22.5±1.9)%。结论ASOX、L-ASOX和D-ASOX在体外均有抗细粒棘球绦虫原头蚴作用,D-ASOX抗原头蚴作用较L-ASOX强。

高强度聚焦超声结合微泡造影剂杀伤原头蚴的效果

目的探讨高强度聚焦超声结合不同比例微泡造影剂对离体原头蚴的杀伤效应。方法在原头蚴悬液中加入不同比例的微泡造影剂(含氟脂质体微泡),以相同超声功率及辐照时间作用(治疗声功率为50W,辐照时间为30s)。台盼蓝排斥试验计数原头蚴杀伤率,光镜检测原头蚴形态结构变化。结果超声剂量一定时,加入适宜比例的微泡造影剂组原头蚴杀伤率比单纯超声辐照组高(P<0.05);随着微泡造影剂比例的增大,原头蚴杀伤率呈增高趋势;原头蚴结构损伤严重,台盼蓝染色深,被膜皱缩体积变小,甚至被膜崩解成碎片,小钩及钙颗粒散在分布。结论 HIFU结合微泡造影剂能增强对离体原头蚴的杀伤效应。

过氧化氢体外诱导细粒棘球蚴原头节细胞凋亡的实验观察

目的探讨过氧化氢(H2O2)体外诱导细粒棘球蚴原头节细胞凋亡。方法体外培养细粒棘球蚴原头节,实验分为2组,即RPMI1640组及RPMI1640添加谷氨酰胺组。分别用不同浓度的H2O2诱导,使其发生细胞凋亡。用原位末端脱氧核糖核苷酸转移酶标记技术(TUNEL法)检测凋亡细胞;用过氧化物酶标记链酶卵白素(SP)染色-免疫组化法检测半胱天冬氨酸蛋白酶-1(caspase-1)、半胱天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)以及FAS基因蛋白(跨膜蛋白Fas)表达情况。表达产物用二氨基联苯胺(DAB)显色,苏木素复染。TUNEL反应以细胞核黄染者为阳性细胞,caspase-1和cas-pase-3以细胞浆被染成棕黄色为阳性细胞,Fas以细胞膜和细胞浆被染成棕黄色为阳性细胞,无黄染者为阴性细胞。根据每个原头节中阳性细胞数所占百分比,对原头节阳性表达程度分为4个级别,即原头节中阳性细胞数<5%为"-",5%～25%为"+",26%～50%为"++",>50%为"+++"。实验重复2次。各组均设空白对照组。结果RPMI1640组,1mmol/LH2O2诱导12h,查见典型的TUNEL反应阳性细胞;诱导4h,caspase-1表达86.6%为"+～++",cas-pase-3表达77.8%为"+～++";诱导8h,caspase-1表达86.6%为"+～++",caspase-3表达80.0%为"+～++"。均比对照组明显增加(P<0.05)。而5mmol/LH2O2诱导4h,caspase-1表达93.0%为"++～+++",caspase-3表达89.5%为"+～++";诱导8h,caspase-1表达"++～+++"降为53.2%,caspase-3表达"+～++"降为48.4%且阴性表达为46.8%,降低显著(P<0.01)。添加谷氨酰胺(终浓度为2mmol/L)组,5mmol/LH2O2诱导8h,caspase-3 100%为"++～+++"高度阳性表达。与平行的RPMI1640组(caspase-3表达"++～+++"为32.2%,且阴性表达为46.8%)相比,变化明显。原头节在对照组和诱导组均可见Fas阳性表达细胞,RPMI1640组5mmol/LH2O2诱导4h,"+～++"表达为53.0%,对照组为20.0%;RPMI1640添加谷氨酰胺组5mmol/LH2O2诱导8h,"+～++"表达为88.7%,对照组为71.4%,诱导后均有所增加(P<0.05)。结论H2O2可诱导细粒棘球蚴原头节细胞凋亡。

细粒棘球蚴-原头蚴体外培养成囊模型的建立

建立原头蚴体外成囊发育的技术方法,为包虫病研究提供实验材料。在CO2培养箱中37℃条件下,单相培养体系中体外培养原头蚴,并用显微镜定期观察其大小及形态变化。结果发现:第10天原头蚴开始向囊发育;在第35～40天出现肉眼可见的囊,存活时间达100 d,最大囊可达2 mm,原头蚴成囊率达90%。

砂生槐子生物碱杀灭原头蚴及抗炎作用

目的研究砂生槐子生物碱体外杀细粒棘球绦虫原头蚴的活性及其抗炎和对小鼠的急性毒性作用.方法用含生物碱(0.75～6.00 mg/ml)的1640培养细粒棘球绦虫原头蚴,0.03%亚甲基蓝拒染法检查原头蚴每天的死亡率;选择昆明小鼠,腹腔注射给药1次,生物碱浓度从150 mg/kg递增,连续观察14 d,记录死亡动物数,计算半数致死量;用二甲苯诱发小鼠耳肿胀动物模型,观察生物碱的抗炎作用.结果砂生槐子生物碱具有体外杀死原头蚴的药理活性,且杀虫作用随药物浓度的增加和作用时间的延长而增强.对小鼠的LD50=(207.81±20.82)mg/kg,对二甲苯诱发的小鼠耳肿胀无明显抑制作用.结论砂生槐子生物碱体外具有杀死原头蚴的活性,对小鼠具有中等强度的毒性,但对二甲苯诱发的小鼠耳急性炎症肿胀无抑制作用.

多房棘球绦虫—泡球蚴的体外培养研究

按照多房棘球绦虫幼虫-泡球蚴培养的培养基(RPMI-1640、M199和MEM)分为3组:Ⅰ组为含10%胎牛血清的RPMI-1640;Ⅱ组为含10%胎牛血清的MEM;Ⅲ组为含10%胎牛血清的M199。将泡球蚴在3种细胞培养液中进行培养,观察其存活、生长以及发育情况。结果显示,培养9 d的泡球蚴的成活率分别为:Ⅰ组90.10%、Ⅱ组50.25%、Ⅲ组22.03%;成囊率分别为:Ⅰ组57.12%、Ⅱ组63.15%、Ⅲ组48.17%;头节外翻率分别为:Ⅰ组98.28%、Ⅱ组88.65%、Ⅲ组75.50%。可见,大多数虫体在早期向囊发育,一部分虫体头节外翻,并伴有规律的伸缩运动,但随时间的延长虫体运动减缓,又向囊蚴发育。通过对多房棘球绦虫泡球蚴的体外培养,初步表明含有10%小牛血清的细胞培养基RPMI-1640较适合泡球蚴的生长发育,为研究寄生虫发育提供了最基本的数据资料。

细粒棘球绦虫原头蚴mRNA测序及表达谱分析

目的通过对细粒棘球绦虫原头蚴的mRNA的测序及表达谱分析,初步建立起细粒棘球绦虫原头蚴的表达谱数据库,了解细粒棘球绦虫原头蚴基因表达及蛋白构成情况,为全面了解细粒棘球绦虫原头蚴生物学特征及寄生虫与宿主之间的关系奠定基础并为新的诊断方法、筛选新的药物靶点和疫苗候选分子选择提供理论依据。方法用TRIZOL法提取人源细粒棘球绦虫原头蚴的总RNA,构建细粒棘球蚴的转录组测序文库,Illumina的solexa测序平台对RNA进行测序并进行生物信息学分析。结果测序结果去杂后得到2G数据,通过从头拼接我们得到18 569个contig,这些contig的总长度为71 329bp,contig平均长度为384bp,最小的contig长度为201bp,最大contig长度为4 618bp,N50(覆盖50%所有核苷酸的最大序列重叠群的长度)为384bp。预测得到unigene为9 029条,将这9 029条基因与NCBI的nr数据库做blast比对,最终有7 441条unigene具有同源比对信息。结论根据GO分析可以发现,共有10 550条unigene与数据库中的基因有较高同源性,且较多的unigene可以与多条基因相对应,一共建立了10 550条对应关系。通过与KEGG数据库进行比对分析,细粒棘球绦虫原头蚴的转录组中有4 731条unigene得到注释,这4 731个得到注释的基因位于241条代谢通路中,这些代谢通路分别与代谢过程,基因信息过程,环境相关过程,细胞过程及与人类疾病相关。

微泡造影剂对高强度聚焦超声杀伤离体棘球蚴的增强作用

目的比较超声造影剂(ultrasound contrast agent,UCA)协同高强度聚焦超声(high intensity focused ultra-sound,HIFU)与单纯HIFU辐照对离体细粒棘球蚴包囊的杀伤效果的不同,探索UCA增强HIFU杀伤棘球蚴的方法。方法采集新鲜包囊按直径大小随机分为6个区组,每组25个,每5个包囊为1试验组随机接受以下试验:普通B超照射的空白对照,0.1mL UCA处理,单纯HIFU辐照,0.1mL UCA+HIFU辐照,0.2mL UCA+HIFU辐照。HIFU辐照后观察分析包囊灰度变化,光镜观察原头蚴形态变化并计数其死亡率。结果 HIFU辐照功率一定时,加入UCA能增加HIFU辐照包囊灰度变化和原头蚴的死亡率,并且该效果随UCA剂量的增加而加强。结论 UCA能增强HIFU对离体细粒棘球蚴杀伤效率,提高对原头蚴的杀伤效果。

超声造影剂协同下的高强度聚焦超声对包虫原头蚴酶活性的影响

为探索高强度聚焦超声结合适宜比例的微泡造影剂对离体细粒棘球绦虫原头蚴酶活性的影响,实验分离包虫原头蚴,在原头蚴悬液中加入比例为1:80的微泡造影剂(含氟脂质体微泡),以声功率为50W的高强度聚焦超声波辐照30s,辐照后悬液涂片作酶组织化学染色,检测原头蚴三磷酸腺苷酶、葡萄糖-6-磷酸酶和琥珀酸脱氢酶的活性。结果显示,超声剂量相同时,微泡造影剂组的原头蚴三磷酸腺苷酶和琥珀酸脱氢酶活性明显低于单纯超声辐照组(P<0.05);葡萄糖-6-磷酸酶活性有一定降低;阴性对照组无酶反应物产生。高强度聚焦超声结合微泡造影剂能增强对离体原头蚴三磷酸腺苷酶和琥珀酸脱氢酶活性的抑制作用。

三维适形调强放疗对骨细粒棘球蚴原头节杀灭效果的实验研究

目的观察三维适形调强放疗(IMRT)对大鼠骨细粒棘球蚴原头节的杀灭效果,探讨IMRT对骨细粒棘球蚴病的治疗有效性。方法选取双股骨骨细粒棘球蚴病大鼠30只,对30只大鼠左侧骨细粒棘球蚴病区给予总剂量为40Gy的IMRT放疗,于放疗结束3d后,取鼠左、右侧股骨细粒棘球蚴原头节,行伊红染色,检测原头节死亡率;采用酶化学染色法检测原头节琥珀酸脱氢酶(SDH)的活性变化,观察IMRT对大鼠骨细粒棘球蚴的治疗效果。结果 IMRT作用3d后,原头节伊红染色结果可观察到,经IMRT治疗的大鼠左侧股骨的骨细粒棘球蚴原头节整体结构消失,出现深蓝色着色,原头节死亡率为(51.22±19.34)%,远高于未经IMRT治疗的右侧骨细粒棘球蚴原头节死亡率(3.55±1.97)%,差异有统计学意义(P<0.05);原头节的琥珀酸脱氢酶(SDH)检测发现,经IMRT治疗的大鼠左侧股骨的骨细粒棘球蚴原头节的琥珀酸脱氢酶活性较右侧明显减弱,且左侧骨细粒棘球蚴原头节琥珀酸脱氢酶SDH产物的平均光密度数值为(0.719 3±0.114 5),远大于右侧的(0.101 5±0.032 0),差异有统计学意义(P<0.05)。结论 IMRT可促进鼠骨细粒棘球蚴原头节的死亡,其作用机制可能是通过改变琥珀酸脱氢酶的活性而实现的。

细粒棘球绦虫原头蚴组织化学的观察

本文对细粒棘球绦虫原头蚴的组织化学成份进行了较为系统和全面的观察,结果表明,该虫体内存在糖原、RNA、DNA、蛋白质结合的α-氨基、酪氨酸、色氨酸及组氨酸、碱性蛋白质、酸性粘多糖、胶原及网状纤维成分、AKP、ATP酶及ACP等生化物质。并对上述成分的定位,含量及其生理学的意义进行了重点讨论。

地塞米松与ATP联用在体外诱导细粒棘球绦虫原头节细胞凋亡的研究

目的探讨地塞米松与三磷酸腺苷(ATP)联用在体外诱导细粒棘球绦虫原头节细胞凋亡的作用。方法体外培养细粒棘球绦虫原头节,分别设地塞米松(5mmol/L)组、ATP(1.6mmol/L)组、地塞米松(5mmol/L)+ATP(1.6mmol/L)组和空白对照组,显微镜下观察原头节变化。药物诱导8h后,选取原头节形态改变最明显的一组和空白对照组,透射电镜观察这两组原头节的超微结构,原位末端脱氧核糖核苷酸转移酶标记技术(TUNEL法)检测原头节中的凋亡细胞,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)活性检测试剂盒检测该酶活性,琼脂糖凝胶电泳检测两组原头节的DNA片段。结果药物诱导8h后观察,与对照组相比,地塞米松组和地塞米松+ATP组的原头节均出现团缩、顶突内凹和体积缩小,钙颗粒明显减少且模糊不清,未见原头节活动,其中地塞米松+ATP组原头节的形态改变更明显,故选择该组作为实验组,与空白对照组进行后续试验。透射电镜观察见实验组原头节中实质细胞体积缩小、细胞膜皱缩、细胞基质浓缩、核异染色质凝集呈团块状或新月形边集于核膜下,表现出凋亡细胞的特征。TUNEL法在实验组的原头节中检测到散在的凋亡细胞,对照组则未见凋亡细胞。实验组caspase-3活性约为对照组的12倍。电泳结果显示,实验组DNA中有约150bp的核小体DNA片段。结论地塞米松与ATP联用可在体外诱导细粒棘球绦虫原头节细胞凋亡。

棘球蚴原头节细胞凋亡的观察

目的观察棘球蚴原头节自身是否存在细胞凋亡现象。方法采集羊肝/肺棘球蚴中自然状态原头节直接用显微镜观察形态结构。过氧化物酶标记链酶卵白素(SP)染色免疫组化法检测半胱天冬氨酸蛋白酶-1(caspase-1)、半胱天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)表达。原位末端脱氧核糖核苷酸转移酶标记技术(TUNEL法)检测凋亡细胞。透射电镜观察原头节超微结构。结果在自然状态的原头节中,显微镜下见到一些原头节虫体枯萎、结构模糊。这些原头节中的caspase-1、caspase-3呈强阳性表达。TUNEL法检测显示这些原头节中凋亡细胞密布。透射电镜见到典型细胞凋亡形态改变。结论棘球蚴原头节自身存在细胞凋亡现象。

抗多房棘球绦虫原头节单克隆抗体的制备

目的制备抗泡球蚴组织单克隆抗体,并鉴定其特异性。方法运用泡球蚴组织粗抗原免疫小鼠制备免疫脾细胞,运用淋巴细胞杂交瘤技术将其与小鼠骨髓细胞SP2/0融合。采用ELISA和免疫组化方法筛选抗泡球蚴原头节单克隆抗体的杂交瘤细胞株。检测所获细胞株的染色体数目,采用ELISA和免疫组化法鉴定所获抗体的特异性。结果获得了一株能稳定分泌的抗泡球蚴原头节单克隆抗体的杂交瘤细胞株6G2A7F7。染色体数目为98条,为明显的融合细胞核型。所分泌的抗体McAbP325能与泡球蚴中的生发层和原头节特异结合,特别对原头节上的小钩和吸盘表现出很强的结合反应。但与棘球蚴(人源)和水泡带绦虫幼虫(细颈囊尾蚴)组织无特异性结合反应。结论制备的杂交瘤细胞能稳定分泌McAbP325,为泡球蚴的细胞分类、免疫组化和抗原研究提供工具和基础。

过氧化氢体外诱导细粒棘球蚴原头节细胞Caspase-3表达及超微结构改变的影响

目的探讨过氧化氢(H2O2)体外诱导细粒棘球蚴原头节细胞凋亡、Caspase-3表达和细胞超微结构的影响。方法RPMI1640添加谷氨酰胺组即体外培养细粒棘球蚴原头节,用5mmol/L H2O2诱导8h,使其发生细胞凋亡。用原位末端脱氧核糖核苷酸转移酶标记技术(TUNEL法)检测原头节细胞凋亡情况,用过氧化物酶标记链霉卵白素(SP)染色半胱天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)。在透射电镜下观察原头节细胞超微结构的变化。结果过氧化氢诱导原头节细胞凋亡细胞增加,caspase-3表达增加,电镜观察原头节细胞异染色质增加,部分细胞染色质异常浓缩呈现凋亡细胞征象。结论H2O2可诱导细粒棘球蚴原头节细胞凋亡,且caspase-3参与原头节细胞的凋亡。

细粒棘球蚴原头节3种重组抗原的双向电泳定位分析

目的利用已有的细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus)原头节3种重组抗原rEgZW-5、rEg14-3-3和rEgP-29获得特异性抗体,以识别双向电泳图谱中相应的蛋白位点。方法十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)初步分离细粒棘球蚴原头节蛋白,预判断蛋白分布情况。应用双向电泳技术分离原头节蛋白,PDquest软件分析原头节的蛋白质数量、相对分子质量(Mr)和等电点(IP)。用原头节的3种重组蛋白rEgZW-5、rEg14-3-3和rEgP-29分别免疫新西兰家兔,制备血清,纯化抗体。蛋白质印迹(Western blotting)鉴定特异性抗体对原头节双向电泳图谱中相应蛋白的识别。结果SDS-PAGE结果显示,细粒棘球蚴原头节蛋白主要分布于Mr18 000～90 000区域。双向电泳分离出240个蛋白位点,为Mr15 790～117 050,IP为4.0～9.5,其中85.8%(206/240)蛋白等电点为5～9。Western blotting结果显示,rEg14-3-3特异性抗体可识别细粒棘球蚴原头节双向电泳图谱中约为Mr33 000、IP为4.86的14-3-3蛋白位点,rEgZW-5特异性抗体可识别约为Mr23 000、IP为4.98的ZW-5蛋白位点,rEgP-29特异性抗体可识别约为Mr29 000、IP为5.65的P-29蛋白位点。结论细粒棘球蚴原头节的3种重组抗原rEgZW-5、rEg14-3-3和rEgP-29的抗体可识别双向电泳图谱中相应的蛋白位点。