重组猪干扰素α发酵纯化与抗病毒活性测定

本研究根据大肠杆菌的密码子偏好性,对UniProt数据库中的猪干扰素α序列(编号:P49879)进行优化,合成了相应的基因片段,并构建了pET-28a-INF-α原核表达载体。将重组载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达,经过20 L发酵罐培养24 h,在OD 600为108时收获细胞。表达的猪干扰素α主要以包涵体的形式存在,经过变性、复性、镍亲和纯化与酶切等步骤,得到了无标签的猪干扰素α蛋白。SDS-PAGE电泳显示,该蛋白的分子量约为19 kDa,纯度高达95%。细胞病变抑制法测定表明,该蛋白的抗病毒活性为1.28×10^(7 )IU/mg。本研究成功获得了高纯度、高活性的猪干扰素α蛋白,为进一步推进蛋白药物在临床上的应用奠定了基础,为进一步重组蛋白工业化生产提供了理论依据。

黑果腺肋花楸发酵果渣多酚的纯化及抗氧化性研究

该研究对前期提取的黑果腺肋花楸发酵果渣中的粗多酚进行分离纯化。通过比较吸附和解吸效果,选择NKA-9作为试验树脂;采用响应面法优化得到的多酚最佳纯化工艺为样液pH值3.0、样液浓度2.0 mg/mL、上样流速2.0 mL/min、乙醇浓度70%和洗脱流速1.0 mL/min,在此条件下,多酚纯度由(11.71±0.20)%提高到(62.61±0.78)%,提高了5.34倍;HPLC分析发现,多酚纯化物中含有绿原酸、金丝桃苷、芦丁、新绿原酸、原儿茶酸、阿魏酸、表儿茶素没食子酸酯、咖啡酸和槲皮素等多酚成分,其中绿原酸含量最高;多酚浓度为55μg/mL时,对DPPH·、·OH和ABTS^(+)·的清除率分别为(96.06±0.45)%、(89.95±0.19)%和(99.33±0.02)%;清除自由基能力及对Fe^(3+)的还原能力显著高于V_(C)对照组。

微生物发酵技术生产水产胶原蛋白肽的研究进展

微生物可以在适宜条件下,将原料经过特定代谢途径,转化为人类所需要的产物。利用微生物转化水产加工下脚料,可以将原料中杂质的去除,胶原蛋白的降解通过发酵工艺同时完成,改善风味的同时节约了成本。该文介绍了微生物发酵法生产水产胶原蛋白肽的原理、发酵条件的选择、肽的分离纯化步骤及其生理功能的研究进展,总结了目前微生物发酵技术制备胶原蛋白肽的优缺点,旨在为发酵法制备具有高生理活性的水产胶原蛋白肽及其市场化应用提供理论依据。

重组人尿激酶原的工业化制备与性质研究

将含有 pET2 9a prouk重组质粒的人尿激酶原工程菌经 10L种子罐培养及 10 0L发酵 ,IPTG诱导表达 ,其表达量为占菌体总蛋白的 2 0 % ,表达产物经体外变复性 ,CM 纤维素离子交换层析 ,Superdex 75分子筛层析及Affi preppolymyxinsupport亲和层析去热源 ,每 10 0L发酵液得重组人尿激酶原纯品 6g ,纯度达 95 %以上 ,比活大于 1.2× 10 4 IU /mg ,双链含量低于0 .5 % ,内毒素及热源含量、宿主蛋白残留量、宿主DNA残留量等均达到临床使用标准 .其分子量 (质谱测定 )、氨基酸组成、N、C 端氨基酸序列分析等均与理论值相符 .

白灵菇多糖研究进展

综述了白灵菇多糖的提取、分离纯化、分子结构、活性功能和菌丝体深层发酵等方面的研究进展,并讨论了白灵菇多糖的研究方向和发展前景。

发酵菜粕中菜籽小肽分离纯化及其体外抗氧化活性研究

研究芝麻粕固态发酵过程中产生的小肽的抗氧化活性。通过福林酚法测定发酵菜籽粕中的蛋白多肽含量为19.15%。从发酵菜籽粕中提取活性小肽,通过Sephadex G-15分离纯化,得到两个分子量不同的小肽,经测定分别是2肽和8肽。分别测定其清除二苯基苦基苯肼(DPPH)自由基活性、用水杨酸法测定其清除羟基自由基(·OH)活性、用铁离子还原法测定其的总还原能力。1 mg/ml的2肽、8肽的DPPH自由基清除率分别为83.47%、76.18%;1.2 mg/ml的2肽、8肽·OH清除率分别达到96.97%、69.27%;3 mg/ml的2肽和5 mg/ml的8肽的总还原力相当于0.5 mg/ml谷胱甘肽。结果提示,固态发酵菜籽粕中的小肽具有较强的还原力,对·OH和DPPH自由基均具有较强的清除作用,且抗氧化性随着小肽分子量的降低而增强。

灵芝发酵菌丝体中灵芝酸的分离纯化及生物活性检测

灵芝深层发酵菌丝体经甲醇提取得到粗灵芝酸,以甲苯:乙酸乙酯:乙酸(12:4:0.5)为展开剂,通过硅胶薄层层析法分离得到三种灵芝酸,命名为M_1,M_2和M_3,其R_f值分别为0.56,0.49,0.17.在优化的硅胶柱层析条件下,即以CH_3OH:CHCl_3=3:97,5:95,1:9为洗脱剂,进行分段洗脱;进样量:硅胶量=1:60;在30m×500mm的层析柱上纯化得到三种灵芝酸.抗菌实验显示,三种四环三萜酸具有抑制大肠杆菌、产气杆菌、肠炎杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌生长的活性.

豆豉纤溶酶的研究进展

豆豉纤溶酶是由豆豉枯草芽孢杆菌分泌的一种具有强烈纤溶作用的丝氨酸蛋白酶。该文对豆豉枯草杆菌的筛选、发酵、酶的提取、活性测定、理化性质以及动物溶栓药效试验进行了综述。

重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体的工业化制备与性质研究

将含有人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(K2tPA)重组表达质粒的工程菌经10L种子罐培养及100L发酵,IPTG诱导表达,其表达量为占菌体总蛋白的20%,表达产物经体外变复性、TI Sepharose亲和层析、SP Sepharose离子交换层析,每100L发酵液得重组人组织型纤溶酶原激活剂缺失变体(K2tPA)纯品4g,纯度达95%以上,比活大于500000IU/mg,内毒素及热源含量、宿主蛋白残留量、宿主DNA残留量等均达到临床使用标准.其分子量(质谱测定)、氨基酸组成、N、C-端氨基酸序列分析等均与理论值相符.同时进行了等电点测定及肽图分析等性质研究.

一种果胶酶生产菌株的分离及其产酶条件优化

为了从自然界中寻找一种果胶酶生产菌株,在果胶平板上经过筛选、复筛,分离出产果胶酶生产菌株,并将分离得到的菌株在摇瓶发酵培养、测定其酶活力,其发酵培养基的初始pH、最适温度、最适接种量及发酵周期进行初步研究.结果表明:经过筛选得到的产果胶酶菌株在发酵培养基的初始pH为7.0、培养温度为33℃、接种量为30%、发酵周期为56 h时,此菌株产酶的酶活力最高,优化后的条件大大提高了菌株的产酶能力.

重组肠激酶在大肠杆菌中的发酵与纯化

对重组肠激酶在大肠杆菌中的高密度发酵表达条件、纯化方法及其生物活性测定进行了研究。结果表明:在E.coli表达系统中,控制温度为37℃,培养基pH 7.4,当A600为8.0时,加入0.3mmol/LIPTG进行诱导,温度降低至30℃,连续诱导3 h,蛋白表达量达25%。经SDS-PAGE测定,纯化的重组肠激酶纯度达80%以上,并能高效切开融合蛋白。

豆豉纤溶酶的研究进展

对豆豉枯草杆菌的筛选、发酵、酶的提取、活性测定、理化性质以及动物溶栓药效试验进行了综述。

一株(海洋)头孢菌的培养条件及抑菌活性实验

对福建崇武海域的生物共生及附生微生物进行筛选分离,得到一株具有一定抗菌活性的海洋真菌S9.通过对海洋真菌S9的生理特性测定和发酵培养,研究该海洋真菌的生长周期及各种参数之间的关系.正交实验表明,海洋真菌S9的最佳发酵方案:蔗糖5 g.L-1,蛋白胨1.5 g.L-1,pH值为6.5,发酵时间为10d.抑菌性能检测表明,发酵液对白色念珠菌有一定的抑制作用.

豆豉纤溶酶的研究进展

综述了含豆豉纤溶酶基因的枯草杆菌的筛选,酶的分离提取、酶学性质、活性测定,豆豉纤溶酶基因的克隆、表达以及动物溶栓药效试验的研究进展。

重组点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶的纯化和鉴定

报道重组点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶 (简称apPEP)的基因工程下游工艺研究。工程菌株E .coliBL2 1/ pKKH PEP表达产物apPEP为可溶性蛋白 ,在NBSBioFlo 30 0 0型 5L自控发酵罐中经 14h培养每升发酵液可达到 2 2 5 g干重菌体 ,含apPEP 3 0g左右。发酵菌体经超声破碎、硫酸铵沉淀后 ,依次经SephadexG 2 5、HighperformanceQsepharoseFF(HP Q)、Phenylseparose 6FF柱层析分离纯化 ,每升发酵产物最终可得 0 86 g纯度达96 %的重组apPEP ,比活力达到 6 5 5u/mg ,整个纯化工艺的蛋白回收率为 8 2 % ,活力回收率为 2 4 4%。纯化的apPEP经电喷雾质谱测定分子量为 76 46 4± 30D ,N端氨基酸序列与基因序列推导的一致。等电点为 pI6 0左右。与Aeromonashydrophila来源的PEP(pI =5 5 )相近。

使用无细胞翻译体系合成尿激酶原突变体蛋白

应用无细胞翻译体系对KGD-尿激酶原重组蛋白质进行表达,表达产物以可溶状态存在,约占体系总蛋白质量分数的5%.使用亲和层析技术对表达产物进行纯化,纯化产物具有较好的分子均一性,并表现出明显的纤溶活性.

小麦制酒精残渣发酵菌种筛选及其产物小肽的抗氧化活性

研究了小麦制酒精残渣固态好氧发酵菌种的筛选以及发酵过程中产生的小肽的抗氧化活性。选用地衣芽孢杆菌D-1和枯草芽孢杆菌KG109与公司现行的酒曲进行比较,试验了接种量、含水量不同水平,以物料水分高和产小肽多为最优组合,并测定其小肽清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基和羟自由基(·OH)活性及总还原力。结果表明,D-1性能最优,接种量3%,含水量70%时,发酵产物中酸溶蛋白和粗蛋白均极显著高于酒曲对照组(P<0.01),其酸溶蛋白含八肽、七肽、五肽、四肽和三肽共5种小肽,除八肽外,其他4种小肽均具有一定的·OH和DPPH清除能力,且5 mg/mL的四肽与0.5 mg/mL谷胱甘肽的总还原力相当。结论:D-1是提高小麦制酒精残渣饲用品质的高效发酵菌种,其固态发酵过程中产生的小肽大部分具有较强抗氧化活性。

发酵鹅肝肽的分离纯化及其抗氧化特性研究

为了提高普通鹅肝的综合利用价值,本研究利用解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)混合发酵制备鹅肝肽,采用Sephadex G-25凝胶层析法分离纯化出发酵鹅肝肽,并对其分离组分进行氨基酸分析和功能特性研究(抗氧化活性、金属螯合率测定),最后通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF)测定高活性组分的相对分子质量。结果表明:Sephadex G-25凝胶层析依次出现P1、P2、P3三个峰;其中P3的必需氨基酸含量(70.32±5.35)mg/100 g明显高于P1(40.06±2.04)mg/100 g和P2(55.39±2.56)mg/100 g,含硫氨基酸(Met、Cys)和疏水性氨基酸(Val、Ile、Leu、Phe、Ala)分别占总氨基酸含量的17.78%和31.31%,均高于P1(8.18%,21.46%)、P2(6.63%,21.53%)。P1、P2、P3均具有较强的抗氧化能力。其中P3的TBRAS值为0.2495±0.016显著低于P1、P2(p<0.01),抑制羟自由基能力,Fe2+螯合率和Cu2+螯合率分别为75.75%±0.49%、72.40%±0.80%和69.04%±0.40%,均显著高于P1、P2(p<0.05);基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴定P3的相对分子质量范围在1.02 ku以下。

Bacillomycin D发酵与纯化工艺优化及其抑菌活性初步研究

为建立高纯度bacillomycin D(杆菌霉素D)脂肽的可放大制备工艺,促进其在农用抗生素领域应用价值的开发,经分离纯化及分子结构鉴定,确定了海洋源解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens TYg 3-2所产活性化合物为bacillomycin D脂肽类抗生素;选择精制过的天然培养基(酵母提取物和蛋白胨),与组分明确的速效碳源、氮源(葡萄糖和硫酸铵)组成复合培养基,结合响应面优化调整培养基配方,建立了bacillomycin D发酵水平高达990 mg/L的5 L罐发酵工艺,其20.62 mg/(L·h)的比生产速率远高于文献报道的10.23 mg/(L·h);在高品质原料基础上,发酵液经菌液分离、酸化沉淀、甲醇浸提、乙醚沉淀、大孔树脂吸附及硅胶柱层析工艺,可高效制备纯度达94.72%的样品。针对所制备的高纯度bacillomycin D样品进行了抑菌活性初步研究,证实其可离体拮抗德氏霉菌、玉米弯孢霉、稻绿核菌和长柄链格孢,并通过盆栽试验证实了bacillomycin D能提升同源芽孢杆菌TYg 3-2的防效,500 mg/L的bacillomycin D与4×10~6 CFU/mL的TYg 3-2菌体混合施用,对黄瓜炭疽病的防效可达95.3%,优于单独施用bacillomycin D(78.4%)和菌体(0)的防治效果。研究初步探索了bacillomycin D在农用抗生素领域的开发价值,同时其高纯度脂肽可放大制备工艺的建立至关重要,不仅能在保全生产菌(其芽孢为生防菌剂原料)的同时从其发酵液中分离和纯化目标脂肽,以促成对农用抗生素价值的深入研究,也能够满足中国农药登记相关毒理学试验对样品的要求(纯度>85%的克量级样品),其结果可为芽孢杆菌源脂肽类抗生素的研究与开发提供参考。

灵芝-黄芪双向发酵菌质多糖的分离纯化及生物活性研究

本文旨在探究灵芝-黄芪双向固体发酵体系对灵芝多糖生物活性的增效作用。分别以灵芝-黄芪双向发酵菌质和未添加黄芪的灵芝菌发酵菌质为原材料提取多糖,采用热水浸提和离子交换色谱对粗多糖进行分离,得到PG-1和PG-2,添加黄芪发酵的菌质多糖中的PG-1组分相较于未添加黄芪发酵的菌质多糖中的PG-2组分增加了325%的产量。对PG-1和PG-2进行初步的结构鉴定和免疫活性、抗肿瘤活性的研究。运用排阻色谱法测定其分子量,高效液相色谱、紫外光谱和红外光谱等方法分析其单糖组成、官能团、糖苷键构型以及糖分子链链型。PG-1和PG-2都由葡萄糖醛酸、葡萄糖、木糖和阿拉伯糖4种组成,单糖组分摩尔比分别为12∶58∶21∶9和16∶41∶32∶11。分子量分别为9.2×10^4和8.9×10^4。PG-1和PG-2均由β-糖苷键连接,二者糖链间有—O—连接。PG-1和PG-2均是具有三螺旋空间构象的分子量相对均一的多糖。体外细胞实验结果显示:加入PG-1和PG-2后,巨噬细胞的增殖作用、巨噬细胞对中性红的吞噬作用、巨噬细胞的保护作用和对肿瘤细胞增殖的抑制作用都显著地提高。在细胞实验中,PG-1显示出比PG-2更强的免疫增强活性和对肿瘤细胞增殖的抑制作用,说明添加黄芪促进了灵芝菌质多糖的分泌,使灵芝多糖的免疫增强活性和抗肿瘤活性增强。