重组G5P蛋白的原核表达纯化及与PrP^Sc结合能力的鉴定

目的利用基因克隆技术制备重组G5P蛋白,并鉴定其结合朊病毒(PrPSc)的能力。方法化学合成G5P全长基因核苷酸片段,将其插入原核表达载体pET-28a-c(+)质粒中,获得pET-28a-c(+)-G5P重组质粒。将其转化到E.coli BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达,经Ni+亲和层析柱纯化,获得纯化重组G5P蛋白。制备重组G5P蛋白偶联磁珠,将其与含有或不含有PrP^Sc的人脑匀浆液混合,进行PrP^Sc的捕获实验。利用Western blot检测技术鉴定重组G5P蛋白与PrP^Sc结合的特异性与结合力。结果成功获得纯化的重组G5P蛋白,捕获实验显示重组G5P蛋白偶联磁珠仅从散发性克雅氏病(sCJD)患者的脑匀浆液中捕获到朊蛋白,而从非CJD患者的脑匀浆液中未捕获到朊蛋白。捕获的朊蛋白经蛋白酶K处理后仍能检出Western blot条带,证明重组G5P蛋白结合的朊蛋白为PrP^Sc而非正常朊蛋白。将sCJD患者的脑匀浆液稀释10000倍后重组G5P蛋白仍可捕获到PrP^Sc。结论该研究利用基因克隆技术成功获得了纯化的重组G5P蛋白。该蛋白具有特异性结合PrP^Sc的能力,并具有较高亲和力。这为下一步研发新型朊病毒检测技术和滤除技术打下基础。

一种基于连续PMCA的PrP^Sc体外扩增方法的建立

为建立一种基于蛋白质错误折叠循环扩增(PMCA)的体外稳定扩增方法以观察PrPSc是否能在体外连续传代,我们分别制备了正常仓鼠和羊瘙痒病因子263K感染的发病仓鼠的全脑匀浆,将两种脑匀浆以不同体积比混合后,分别进行144个循环的直接PMCA和每轮48个循环、共8轮的连续PMCA,用Western blot对PrPSc的扩增情况进行检测。结果显示,与常规的直接PMCA方法相比,连续PMCA能更有效地使低浓度的PrPSc扩增到可检出的水平,表明连续PMCA可以支持羊瘙痒因子263K在体外长期稳定的复制。连续PMCA方法是一种体外高效地扩增PrPSc的方法,有潜力成为一种Prion体外培养方法,用于研究Prion错误折叠和复制机制,以及检测脑组织、外周组织和体液样品中的微量PrPSc。

淋巴组织PrP^sc的快速检测及其在羊痒疫监测中的应用

羊痒疫是一种致命、长潜伏期、以海绵样脑病变为特征的传染性海绵样变性脑病（TSE），PrP^sc是其致病阑子。PrP^sc在感染动物淋巴组织中的积聚先于中枢神经系统（CNS），故此部位PrP^sc的检测具有早期诊断意义；但现有的商业化PrP^sc检测试剂盒只适用于检测CNS，而检测淋巴组织所使用的Western印迹（WB）检测方法需浓缩淋巴组织标本且耗时长，不适用于监测。本文作者建立了检测淋巴组织内PrP^sc快速WB方法，并检测了死亡羊的脑组织和扁桃体。

朊病毒病实验动物脑组织PrP^Sc样本库的建立

目的建立朊病毒病实验动物脑组织检测样本库，检测其在特定保存条件下的稳定性，以用于动物和人朊病毒病诊断技术的评估和考核。方法选用30只经颅内注射感染羊瘙痒因子263K的仓鼠和30只正常仓鼠，每只分别制备10％、1％和0．5％3种浓度的脑组织匀浆，分装冷冻保存。以Western Blot方法确定脑组织匀浆中PrP^Sc的存在情况，并分别在建库半年和3年检测PrP^Sc的稳定性。结果30只感染仓鼠10％脑组织匀浆全部可检出PrP^Sc，1％脑组织匀浆有26份为PrP^Sc阳性，0．5％脑组织匀浆有19份为PrP^Sc阳性。半年及3年后复检，PrP^Sc阳性检出率基本不变。所有正常仓鼠脑匀浆均为PrP^Sc阴性。结论建立了稳定性良好的含有90份PrP^Sc阳性标本和90份PrP^Sc阴性样本的朊病毒病实验动物脑组织榆测样本库。

羊瘙痒病小鼠适应株139A可突破种属屏障颅内感染金黄地鼠

羊瘙痒病感染因子可以根据疾病发生的潜伏期、临床病程、神经病理学特征以及PrPSc分子特征等分为不同的毒株,目前已经证实有20余种。在可传播性海绵状脑病的发病过程中存在着明显的种属屏障作用。将小鼠适应株139A颅内接种至金黄地鼠,以观测感染因子对种属屏障的突破及感染特征。在接种385～405天后,感染动物出现明显症状,与以往报道的金黄地鼠适应株263K不同,139A毒株发病动物出现严重的瘙痒,而无明显的共济失调。感染动物自出现明显症状到死亡的时间明显长于263K毒株感染金黄地鼠。进一步脑组织电镜和Westernblot检测证实,存在有羊瘙痒病相关纤维和PrP-res。这证明小鼠适应株139A可突破种属屏障感染金黄地鼠。经系统比较,139A和263K毒株在潜伏期、主要临床症状和临床病程显示出明显的差异,而PrP-res的泳动位置和糖基化比率差异不大,仅139A毒株的单糖基化分子位置似乎略高于263K。动态观测处于潜伏期的接种动物脑组织羊瘙痒病相关纤维和PrP-res,发现PrPSc的出现明显早于临床症状。

单抗介导牛海绵状脑病免疫组化检测方法的建立及其应用

中国鲁西黄牛重组 PrPc成熟蛋白免疫 PrPc基因敲除小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术,经免疫组织化学试验筛选出单抗4C11可特异识别牛海绵状脑病标准阳性牛脑样品上PrPSc核心片段。以单抗4C11为核心试剂,建立了单抗介导牛海绵状脑病免疫组织化学检测方法,并已颁布成为中华人民共和国国家标准 GB/T19180-2003(牛海绵状脑病诊断技术)。已应用于中国牛海绵状脑病的持续监测,至 2002 年底共检测了全国各地 3344 份牛脑样品,结果全为阴性,且每批次所设的阳性对照样品检测结果均呈阳性,与 Roche 公司单抗 6H4 检测结果的符合率为 100%。

羊瘙痒因子263K感染的金黄仓鼠脑中PrP^(Sc)的动态沉积特点

目的 观察羊瘙痒因子 2 63K感染的金黄仓鼠脑中PrPSc的沉积特点。方法 颅内接种羊瘙痒因子 2 63K感染金黄仓鼠 ,分别于接种后第 2 0天、40天、50天、60天和 70天取脑组织 ,用免疫组化法检测PrPSc的沉积 ,HE染色观察病理变化 ,Westernblot检测蛋白酶抗性PrPSc。结果 颅内接种 2 63K后第 2 0天 ,脑组织中即可检测到耐热和耐蛋白酶K的PrPSc的沉积 ,呈散在分布 ;第 40天可见细胞内PrPSc的沉积 ,第 50天脑组织中出现灶性、颗粒状、细胞内PrPSc的沉积 ,累及部位扩大 ,第60 - 70天可见弥漫性呈桑葚状、斑块状沉积物。PrPSc主要沉积于大脑皮质Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ层 ,海马锥体细胞层 ,小脑皮质颗粒层。HE染色结果显示大脑皮质海绵样病变在接种后 40天出现 ,随着接种时间的延长而加剧。Westernblot检测显示PrPSc在接种后 40天即可检出 ,PrP总量和PrPSc含量随着接种时间的延长而增加。结论 随着接种时间延长 ,羊瘙痒因子 2 63K感染的金黄仓鼠脑中PrPSc沉积累及的范围、程度扩大 ,IHC检测脑组织中PrPSc的沉积早于临床症状的出现 ,甚至其它检测方法的检出。

朊病毒研究进展

朊病毒是一种只含蛋白质而不含核酸的蛋白侵染颗粒 ,能造成哺乳动物的脑部病变 ,它是由正常的蛋白错误折叠成致病蛋白而组成的 ,两种结构不同的蛋白 Pr Pc 和Pr PSc来源于同一基因 ,具有相同的氨基酸序列和共价修饰 ,但在某些方面存在着很大的差别。朊病毒的繁殖是通过正常形式蛋白转变为致病形式完成的。

羊瘙痒因子263K经灌胃感染仓鼠动物模型的建立

目的 胃肠感染是大多数动物类传染性海绵状脑病(TSE)传播的最主要途径。建立羊瘙痒因子263K灌胃感染仓鼠动物模型,并研究其发病特征。方法 Scrapie 263K毒株低剂量和高剂量经灌胃途径接种金黄仓鼠,在终末期取脑组织,用HE染色观察病理变化,免疫组化法检测PrPSc 的组织沉积特点, Western blot 检测PrPSc 分子特征。结果 低剂量灌胃组仅一只动物发病,高剂量组所有接种动物均发病,潜伏期较颅内注射组明显延长。在脑组织中观察到典型的病理改变;PrPSc免疫组化检测显示弥漫性沉积于脑组织,主要累及脑干、大脑皮层深层、小脑,基本与病理学改变累及的区域一致;Western Blot检测发现感染动物脑提取物出现可抵抗蛋白酶消化的PrPSc条带,与颅内注射组脑组织提取物中PrPSc电泳性状完全一致。结论 羊瘙痒因子263K灌胃可成功引起动物发病,与颅内注射比较,潜伏期、神经病理变化和PrPsc沉积均有不同,可能受到感染途径的影响。

羊瘙痒因子263K经多种途径感染仓鼠的脑外组织PrP^(Sc)分子和沉积特点研究

目的 比较研究实验仓鼠经不同途径感染羊瘙痒病 (Scrapie)毒株 2 6 3K的终末期病鼠脑外组织内PrPSc分子和沉积特点。方法 以Scrapie 2 6 3K毒株经颅内、腹腔、心内、肌肉注射及灌胃等途径接种金黄地鼠 ,在终末期取脑、脊髓、脾、肾、舌、肌肉、小肠回盲部和胃组织 ,用HE染色观察病理变化 ,免疫组化法检测PrPSc的组织沉积特点 ,Westernblot检测PrPSc分子特征。结果 五种感染方式均可引起动物发病 ,在脑和脊髓组织中观察到典型的病理改变 ;PrPSc免疫组化检测显示外周途径感染动物脊髓白质内有大量沿纤维走行的PrPSc沉积 ,灰质前后角内围绕空泡点状或网状沉积 ,而颅内感染主要在中央管附近和后角出现大量的点状PrPSc沉积 ;脾脏、肾、小肠回盲部、胃组织中均观察到点状PrPSc的沉积 ;WesternBlot检测发现不同感染途径动物脊髓提取物均出现可抵抗蛋白酶消化的PrPSc条带 ,与脑提取物中PrPSc电泳性状完全一致 ;外周组织仅在脾脏检测到抵抗蛋白酶消化的PrPSc,但与正常对照比较 ,各种组织中PrP的总量明显增高 ,同时呈现与中枢神经组织不同的PrP电泳特征。结论 在TSE感染发病过程中 ,多种组织细胞成分可能参与了TSE感染因子的向中枢神经系统传递过程 。

毛细管电泳及其在朊病毒检测中的应用

本文简单介绍了毛细管电泳(CE)的发展前景,较详细地综述了毛细管电泳在朊病毒(PrPSc)检测方面的应用。CE作为1990年代末期发展最快的分析化学领域,已经在可传播性海绵状脑病(TSEs)的诊断检测方面显示了特有的优越性,成为目前唯一可以检测血中PrPSc的方法,为实现TSEs的生前诊断提供了新的思路。

PrP的胞内运输与朊病毒病

朊病毒病,即传染性海绵状脑病(transmissiblespongiformencephalopathies,TSEs),是一类致死性的神经退行性疾病,存在散发性、感染性和遗传性3种形式。在朊病毒病的病理过程中,细胞正常朊蛋白PrPC(cellularPrP)转化为异常构象的PrPSc(scrapiePrP)是至关重要的,但是朊病毒的增殖如何导致神经元凋亡仍不清楚。PrPC的胞内运输在朊病毒病中发挥重要作用,朊病毒感染后PrPC转化为PrPSc,及遗传性朊病毒病中PrP突变可能影响PrP的生物合成、亚细胞定位及转运过程,通过干扰PrPC的正常功能或产生毒性中间体而导致神经系统病变。现对近年来关于PrP胞内运输在朊病毒病中的作用进行综述。

朊病毒疾病

朊病毒是一种蛋白性质的感染颗粒,它能引起动物的一类大脑功能紊乱疾病:可传染海绵样脑病(TSE)。本文就朊病毒、朊病毒引起的疾病、牛海绵样脑病(BSE)及BSE能否传给人类进行一些讨论。

朊病毒及其相关疾病的免疫学研究

朊病毒(prion)作为引起动物和人类朊病毒相关疾病的病原体,从上世纪初起就受到人们的高度关注。然而朊病毒不同于一般的病毒、细菌等病原体,它与免疫系统之间有着极其复杂的相互关系,因此对它的研究在免疫学领域历经坎坷。本文将着重介绍和讨论近年来朊病毒在免疫学领域的新发现,以及免疫学在朊病毒相关疾病的发生、发展上的新方法、新理论和应用状况,为研究朊病毒相关疾病在免疫学上的检测、治疗方法提供新方向和新思路。

PrP^C转化成PrP^(Sc)的影响因素研究进展

朊病毒蛋白有两种形式,即PrPC和PrPSc。PrPC是正常的细胞蛋白;而PrPSc是PrPC的异构体,具有致病性。大量的证据表明朊病毒是由PrPC错误折叠从而转变成PrPSc的,朊病毒病的发生与发展与PrPC转变成PrPSc密切相关,朊病毒病属于蛋白质构象病。本文将着重叙述PrPC转化成PrPSc的各种影响因素。

蛋白质感染颗粒与二价铜离子

蛋白质感染颗粒 (PrP)的错误折叠被认为是引起一些神经退化性疾病的主因 ,但其正常构象 (PrPC)的功能却一直不为人所知 .近年来研究发现 ,在正常细胞中 ,尤其是脑细胞中 ,细胞膜PrPC 可通过内吞作用进入细胞质而将Cu2 + 载运至SOD1,从而参与调节SOD1的活性及细胞铜代谢 .另有研究表明 ,Cu2 + 对于PrPSc (错误构象 )的蛋白水解酶K抗性的恢复及不同“病株”