牙龈卟啉单胞菌prtC基因原核表达系统构建及牙周损伤与局部 PrtC水平的关系(英文)

目的构建牙龈卟啉单胞菌胶原酶基因prtC原核表达系统并鉴定其表达产物的抗原性和免疫反应性,确定牙周损伤与其局部PrtC水平之间的关系。方法采用高保真PCR从牙龈卟啉单胞菌ATCC33277和47A1株扩增出全长prtC基因片段,TA克隆后测序。采用pET32a质粒和大肠杆菌BL21DE3株构建prtC基因原核表达系统,并用不同浓度的IPTG诱导目的重组蛋白rPrtC的表达。采用Westernblot检测rPrtC的抗原性和免疫反应性。建立ELISA,检测人慢性牙周炎龈下菌斑标本中的PrtC水平。结果牙龈卟啉单胞菌ATCC33277和47A1株prtC基因核苷酸序列完全相同。与报道的相应序列比较,克隆的prtC基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为98.46%和99.07%。在不同浓度的IPTG诱导下,rPrtC的产量高达细菌总蛋白的50%左右。rPrtC能与牙龈卟啉单胞菌全菌抗体结合,并能有效地诱导家兔产生特异性抗体。91.39%的人慢性牙周炎龈下菌斑标本中可检出PrtC,重度牙周炎标本中PrtC水平明显高于轻度牙周炎(P<0.05)。结论本研究成功地构建了牙龈卟啉单胞菌prtC基因高效原核表达系统。rPrtC具有良好的抗原性和免疫反应性,可作为研制牙龈卟啉单胞菌疫苗和血清学检测试剂盒的候选抗原。人慢性牙周炎的牙周破坏程度与局部PrtC水平密切相关。

牙龈卟啉菌及其胶原酶基因遗传多样性的研究

目的 分析牙龈卟啉单胞菌细菌基因型及其重要毒力因子胶原酶基因PrtC的遗传异质性 ,了解细菌遗传变异与其致病性的相关性。方法 对从不同牙周炎患者口腔中分离出的牙龈卟啉菌进行DNA指纹分析 ,参考菌株为PgATCC332 77。通过PCR反应 ,检测临床菌株中是否存在特异性的胶原酶基因片段 (548bp)。并通过酶切鉴定和DNA序列分析 ,了解PrtC基因遗传多样性的变化。结果 80株牙龈卟啉菌共获得 7种基因型 (Ⅰ～Ⅶ )。所有 2 4株临床菌株和参考菌株PgATCC332 77中均扩增出特异性的胶原酶基因片段。对照菌株中没有得到相应的产物。 4株细菌的序列分析结果与国外的报道相比较 ,发现一些基因序列存在差异 ,出现 6个核苷酸碱基缺失。结论 临床分离的牙龈卟啉菌中可检测到多种基因型 ,且具有个体差异 ,这些菌株具有合成胶原酶的能力 。

慢性牙周炎龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌胶原酶水平与牙周病变程度的关系

目的检测慢性牙周炎(chronicperiodontitis,CP)患者龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis,Pg)胶原酶基因prtC及其产物PrtC,了解PrtC水平与牙周病变程度的关系,确定PrtC诱导细胞分泌炎性细胞因子的作用。方法采用SDSPAGE检测原核表达系统重组PrtC(rPrtC)表达和NiNTA亲和层析法提取的rPrtC纯度。rPrtC免疫家兔获得抗血清。建立多重PCR检测56例CP患者209牙位的龈下菌斑标本中Pg16SrDNA和prtC基因。建立ELISA检测上述标本中的PrtC,并分析PrtC水平与牙周病变程度的关系。采用ELISA检测rPrtC诱导人脐静脉内皮细胞EVC304分泌IL1α、IL8和TNFα的作用。结果rPrtC表达产量约占细菌总蛋白的50%。提纯的rPrtCSDSPAGE后仅见单一的蛋白条带。96.1%(201209)和92.3%(193209)的龈下菌斑标本分别Pg16SrDNA和prtC基因PCR阳性,91.4%的龈下菌斑标本(191209)PrtCELISA阳性。重度CP龈下菌斑标本中PrtC含量明显高于轻度和中度CP标本(P<0.05),但轻度和中度、中度和重度CP标本之间PrtC含量差异无统计学意义(P>0.05)。1μg的rPrtC作用EVC304细胞24h后,5和10μg的rPrtC作用EVC304细胞12h后均可使EVC304细胞分泌的IL1α、IL8和TNFα水平明显增高(P<0.05)。结论Pg有很高的prtC基因携带率和表达率。CP牙周病变程度与龈下PrtC水平密切相关。rPrtC有直接诱导细胞合成并分泌IL1α、IL8和TNFα的活性。