牛肺炎链球菌重组PsaA蛋白对牛胚气管上皮细胞黏附抑制作用的研究

为研究牛肺炎链球菌的黏附蛋白—肺炎链球菌表面黏附素A (PsaA)对牛肺炎链球菌黏附牛胚气管上皮细胞的影响,本研究利用PCR扩增牛肺炎链球菌psaA基因,构建重组质粒pET32a-PsaA,经双酶切和测序鉴定正确后,将阳性重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞后进行IPTG诱导表达,采用SDS-PAGE和western blot鉴定重组PsaA蛋白(rPsaA)的表达情况及反应原性,结果显示,rPsaA在上清和沉淀中均获得了表达,且具有较好的反应原性。将牛胚气管上皮细胞与1.3×10^(8)cfu/mL的牛肺炎链球菌稀释液于37℃共孵育后,利用间接免疫荧光试验(IFA)检测牛肺炎链球菌对牛胚气管上皮细胞的黏附性,结果显示,可观察到黏附在牛胚气管上皮细胞的牛肺炎链球菌的绿色荧光,即牛肺炎链球菌可以黏附牛胚气管上皮细胞。利用牛肺炎链球菌稀释液孵育经不同浓度rPsaA预处理的牛胚气管上皮细胞后,对黏附的细菌计数,结果显示,rPsaA可以极显著减少牛肺炎链球菌对牛胚气管上皮细胞的黏附菌数(P<0.01)。利用本研究制备的rPsaA多克隆抗体和肺炎链球菌阳性血清分别与牛肺炎链球菌作用后,与牛胚气管上皮细胞孵育,对黏附的细菌计数,结果显示,rPsaA多克隆抗体与肺炎链球菌阳性血清均能有效减少牛肺炎链球菌对牛胚气管上皮细胞的黏附数。本研究经原核系统表达了牛肺炎链球菌rPsaA,并首次证明rPsaA具有影响牛肺炎链球菌黏附牛胚气管上皮细胞的作用,该结果为探究抑制肺炎链球菌黏附呼吸道上皮细胞的机理以及肺炎链球菌亚单位疫苗的研究奠定了基础。

坛紫菜叶绿体psaA基因片段的序列分析

根据日本kazusaDNA研究所收录的坛紫菜EST序列AV434021和AV433683设计引物,对坛紫菜配子体的RNA进行RT-PCR扩增,得到产物长度为480 bp。利用DNAstar、Clastal1.81等专业软件进行分析,结果表明,所得产物为紫菜叶绿体的psaA基因片段,其G+C含量为55.9%。G+C含量明显高于A+T的含量;对按核酸序列推导的蛋白序列进行二级结构和三级结构预测,该蛋白存在3个α螺旋和2个β折叠。

花叶矢竹psaA基因克隆及功能分析

光系统I(PS I)主要分布在类囊体膜的非垛叠部分,由反应中心复合体和捕光复合体I(LHC I)等亚单位组成。PS I反应中心复合体的功能是将电子从PC传递给铁氧还蛋白,psa A所编码的蛋白Psa A是复合体重要组成部分。研究基于psa A高保守性,扩增出psa A全长序列,获得其编码区2516bp。对该序列及其推导出的氨基酸序列结构进行分析,将之与其他禾本科植物的psa A氨基酸序列进行同源性比较,并构建出基于psa A的系统进化树。通过定量RT-PCR调查了psa A基因在花叶矢竹叶色变异过程中表达丰度变化,分析其在花叶矢竹叶片发育过程中的作用,为进一步探讨花叶矢竹叶色变异的分子机理奠定一定的基础。

高粱叶绿体psaA基因的克隆和核苷酸序列分析

我们克隆了含高粱叶绿体psaA基因的6.7kb EcoRI酶切片段,进行了限制酶图谱分析和核苷酸序列结构测定,所测核苷酸序列总长为3080bp,其中高粱叶绿体psaA基因序列为2253bp,编码一个含750个氨基酸残基的蛋白质,其分子量为83000Da。高粱psaA基因的核苷酸序列与玉米、水稻、菠菜的同源性分别为99.4%、96.3%和89.4%;推导出的氨基酸序列的同源性分别为99.3%、98.0%和95.7%。C_4植物与C_3植物比较,由于P_(700)脱辅基蛋白的第493位氨基酸性质的不同(Gly→Arg,Ser),而导致了它们的多肽在疏水性图谱上的差异。

肺炎球菌表面蛋白的克隆表达与免疫原性研究

从肺炎球菌YF05中扩增了肺炎球菌表面蛋白A(PspA)和肺炎球菌表面黏附素A(PsaA)基因,以pET27b(+)为载体构建了重组表达质粒的表达系统后,转化入大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,表达的重组蛋白约占菌体总溶解蛋白的75%,结果显示:表达的PspA蛋白和PsaA蛋白,分子量分别约为75kDa和37kDa。成功表达的重组蛋白具有较强的免疫活性和交叉免疫效果。