应用于pol-miR-26a,26b靶基因检测的psiCHECK-dmrt1-3'UTR报告质粒的建立

为明确牙鲆雄性性别相关关键基因dmrt1 (doublesex and mab-3-related transcription factor 1)是否为pol-miR-26a、pol-miR-26b作用的靶基因,本研究利用PCR技术克隆了dmrt13'UTR区,并成功引入了特殊限制性内切酶PemⅠ和NotⅠ的识别位点;将得到的dmrt1 3'UTR区片段和psiCHECK-2载体进行双酶切、连接后得到野生型重组质粒;并且利用定点诱变法对dmrt1 3'UTR区进行体外定点诱变,将pol-miR-26a、pol-miR-26b识别的靶序列ACTGAA突变为TGACTT,形成突变型重组质粒。经琼脂糖凝胶电泳鉴定、双酶切及测序分析,成功获得了可用于pol-miR-26a、pol-miR-26b的靶基因dmrt1验证的野生型psiCHECK-dmrt1-3'UTR和突变型psiCHECK-mutated dmrt1-3'UTR的报告质粒,为进一步研究pol-miR-26a、pol-miR-26b的靶基因dmrt1鉴定和功能奠定了基础。