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Cloning and screening of cDNA of Psilgramma menephorn allergen
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作者 刘昀 孙秀珍 +1 位作者 张王刚 李维 《Journal of Pharmaceutical Analysis》 SCIE CAS 2007年第2期195-199,203,共6页
Objective To construct a cDNA expression library of Psilgramma menephorn to screen its major allergen so as to provide the basis for producing recombinant allergen vaccine of Psilgramma menephorn. Methods Total RNA wa... Objective To construct a cDNA expression library of Psilgramma menephorn to screen its major allergen so as to provide the basis for producing recombinant allergen vaccine of Psilgramma menephorn. Methods Total RNA was extracted from the whole body of Psilgramma menephorn with Trizol and mRNA was purified with Oligo (dT) Spin-Column. And dscDNA was synthesized through reverse transcription. After blunting, the cDNA fragments were ligated with EcoRⅠ adapters. Then the cDNAs were digested by XhoⅠ, and the fragments less than 400 bp were removed by using GHROMA SPIN-400 column. The remaining fragments longer than 400 bp were ligated with Uni-ZAP XR vector. The recombinants were packaged in vitro and a small portion of the packaged phage was used to infect E.coli XL1-Blue MRF′ for titration. The recombinants were examined by color selection. The size of cDNA inserts and the diversity of library were analyzed by PCR. The library was screened using SPT positive sera from patients with Psilgramma menephorn allergy repeatedly. Results The cDNA expression library consisting of a 5×105 recombinant bacteriophages was constructed with the recombinant ratio of 67%. The average length of recombinant exogenous inserts was about 1.49 kb. Five positive cDNA clones were obtained. Conclusion The constructed cDNA expression library shows appropriate contents and size of cDNA fragments and the related genes of Psilgramma menephorn major allergens were harbored successfully, which lays the foundation for the positive clone identification and further analysis. 展开更多
关键词 psilgramma menephorn cDNA expression library CLONE SCREENING
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霜天蛾cDNA表达文库的构建和初步鉴定 被引量:11
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作者 孙秀珍 刘昀 《西安交通大学学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2005年第3期244-246,279,共4页
目的构建霜天蛾cDNA表达文库,为进一步筛选霜天蛾主要变应原、制备重组变应原奠定基础。方法利用Trizol法抽提霜天蛾RNA,经过Oligo(dT)纤维素柱纯化后得到mRNA,反转录合成dscDNA,连接EcoRⅠ接头,末端磷酸化,XhoⅠ消化,将双末端黏性化的... 目的构建霜天蛾cDNA表达文库,为进一步筛选霜天蛾主要变应原、制备重组变应原奠定基础。方法利用Trizol法抽提霜天蛾RNA,经过Oligo(dT)纤维素柱纯化后得到mRNA,反转录合成dscDNA,连接EcoRⅠ接头,末端磷酸化,XhoⅠ消化,将双末端黏性化的双链dscDNA经过凝胶柱层析,收集大于400bp的cDNA片段,加工后与UniZAPXRVector连接,经过体外包装,感染宿主菌,构建cDNA文库,检测文库容量和重组效率,并采用PCR方法对插入的cDNA片段大小进行分析。结果成功构建了一个含有5×105重组子的霜天蛾表达文库,重组率为67%,平均插入片段长度约为1.49kb。结论所建文库容量及插入片段大小合适,适用于筛选目的cDNA克隆。 展开更多
关键词 霜天蛾 CDNA表达文库 鉴定
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霜天蛾昆虫变应原的变应原性及免疫原性分析 被引量:1
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作者 孙秀珍 刘昀 +3 位作者 周玎 李维 冯向莉 徐晶 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2008年第7期1161-1164,共4页
目的分析霜天蛾主要变应原的变应原性和免疫原性,为进一步制备霜天蛾标准化变应原疫苗和基因工程重组霜天蛾昆虫变应原奠定基础。方法应用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳对霜天蛾变应原蛋白成分进行分离,对9例霜天蛾过敏患者血清分别进行IgE... 目的分析霜天蛾主要变应原的变应原性和免疫原性,为进一步制备霜天蛾标准化变应原疫苗和基因工程重组霜天蛾昆虫变应原奠定基础。方法应用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳对霜天蛾变应原蛋白成分进行分离,对9例霜天蛾过敏患者血清分别进行IgE、IgG免疫印记分析,并对比分析IgE、IgG反应变应原成分。结果霜天蛾提取液经SDS-PAGE染色后显示出20余种蛋白质成分,相对分子质量12000-128000。免疫印迹分析结果显示具有变应原性的蛋白相对分子质量及反应率分别为:74000(88.9%),66000(22.2%),49000(22.2%),36000(77.8%),25000(33.3%),具有免疫原性的蛋白相对分子质量及反应率分别为:79000(33.3%),74000(66.7%),66000(22.2%),49000(22.2%),36000(44.4%),25000(55.6%)。结论霜天蛾变应原中具有较强变应原活性的蛋白质相对分子质量为74000和36000,具有较强免疫原活性的蛋白质相对分子质量为74000和25000的蛋白质,是霜天蛾过敏患者特异性过敏诊断和治疗的主要成分。 展开更多
关键词 霜天蛾 变应原 昆虫 变应原性 免疫原性
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霜天蛾主要变应原的克隆、筛选及序列分析
4
作者 刘昀 孙秀珍 +3 位作者 张王刚 李唯 冯向莉 徐晶 《南方医科大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第8期1145-1148,共4页
目的对霜天蛾cDNA表达文库进行免疫学筛选,分离和鉴定霜天蛾主要变应原阳性克隆,并测定和分析阳性克隆变应原cDNA序列,为制备重组霜天蛾昆虫变应原疫苗和疫苗的标准化奠定基础。方法构建λZAPⅡ噬菌体霜天蛾表达文库,应用霜天蛾免疫多... 目的对霜天蛾cDNA表达文库进行免疫学筛选,分离和鉴定霜天蛾主要变应原阳性克隆,并测定和分析阳性克隆变应原cDNA序列,为制备重组霜天蛾昆虫变应原疫苗和疫苗的标准化奠定基础。方法构建λZAPⅡ噬菌体霜天蛾表达文库,应用霜天蛾免疫多克隆兔血清和霜天蛾特异性过敏患者血清反复筛选霜天蛾cDNA表达文库,所得的阳性克隆经转化克隆至pBluescript质粒,PCR扩增cDNA片段,并对片段进行序列测定、分析。结果对5×104的噬菌体斑进行免疫学筛选,成功获得5个阳性克隆。经PCR扩增并测序分析表明,5个阳性克隆基因与GenBank中已知基因无明显同源性。结论筛选出5个霜天蛾主要变应原的新基因,为霜天蛾过敏患者的特异性免疫治疗及进一步的实验研究奠定基础。 展开更多
关键词 霜天蛾 变应原 基因克隆 免疫学筛选 序列分析
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