pta基因敲除对L-色氨酸发酵的影响

【目的】探究pta基因缺失对大肠杆菌发酵生产L-色氨酸的影响。【方法】运用Red重组技术敲除pta基因,构建pta缺失株E.coli TRTHΔpta。利用30 L发酵罐进行分批补料发酵试验,考察重组菌E.coliTRTHΔpta发酵生产L-色氨酸过程中生物量、L-色氨酸产量、有机酸含量、发酵液中NH 4+浓度及变化。建立了大肠杆菌合成L-色氨酸的代谢流平衡模型,应用MATLAB软件计算出E.coli TRTH及其pta缺失株发酵中后期代谢网络的代谢流分布。【结果】发酵结果显示,pta缺失株能够以较长时间和较高比生长速率保持对数生长,最终菌体生物量和L-色氨酸产量分别提高了52.7%和46.8%。有机酸含量分析结果表明,pta缺失株乙酸含量显著降低,只有2.5 g/L,仅为亲株的19.5%;丙酮酸和乳酸的含量有一定增加。多参数分析结果显示,pta缺失株发酵过程中NH 4+浓度较亲株降低33.2%。pta缺失株发酵生产L-色氨酸的代谢流量分析结果表明,EMP途径的代谢流量降低7.4%,PP途径的代谢流量增加8.4%,TCA循环的代谢流量降低32.2%。【结论】pta基因的缺失导致在发酵生产L-色氨酸过程中代谢流发生变化,乙酸含量的显著降低解除了乙酸对菌体生长和产物生成的抑制,使得菌体生物量和L-色氨酸产量大幅提高。

CryIA(a)-pta双价抗虫基因转化粳稻及二化螟抗性评估

向作物中转多价抗虫基因是增强作物抗虫性、拓宽抗虫谱、延长抗虫时限的有效措施。从粳稻品种吉粳81、吉粳88和通887的成熟胚诱导出愈伤组织,以愈伤组织作为转化的受体,利用农杆菌介导法,转化苏云金杆菌毒蛋白基因CryIA(a)和半夏凝集素(Pinelliaternataagglutinin,PTA)基因。表达双价抗虫基因的载体p3300-bt-pta的bt和pta分别由Ubiquitin启动子和CaMV35S启动子驱动,宿主菌株为EHA105。用除草剂草丁膦(PPT)筛选得到转基因植株25株。以bt基因和pta基因两端序列为引物在一个反应体系同时做2个基因的PCR检测,检测到bt、pta基因的2条带,Bar基因的PCR检测也显阳性。转化株对PPT除草剂抗性鉴定呈抗性,证明外源基因已整合到水稻基因组中。水稻二化螟接虫鉴定结果表明,23株转基因植株抗虫性比对照明显提高,2株表现感虫。

人血小板T细胞活化抗原PTA1基因探针的制备及初步鉴定

目的：制备地高辛标记的PTA1基因探针，以用于PTA1表达及功能的研究．方法：根据新克隆的人PTA1基因序列，设计针对PTA1分子不同结构域的引物，通过PCR扩增、地高辛标记的方法制备基因探针．结果：细胞原位杂交方法证实这种探针具有较高的敏感性和特异性．结论：PTA1基因探针的制备为进一步研究PTA1分子的分布、表达及功能打下了较好的基础．

双价抗虫植物表达载体p3300-bt-pta转化苜蓿的初步研究

以中苜1号无菌苗子叶为外植体,采用农杆菌介导的叶盘法,将含有CryIA(a)/CryIA(c)基因、半夏凝集素(pta)基因和bar基因的双价抗虫植物表达载体p3300-Bt-pta导入苜蓿子叶中,在含除草剂的筛选培养基中连续筛选,获得抗性转化植株。研究了农杆菌菌液浓度、浸染时间、共培养时间等因素对苜蓿转化效率的影响,结果表明:各因素对苜蓿转化率均有不同程度的影响,当转化的菌液浓度OD600为0.6、浸染时间为10min、共培养时间为3d时转化效率较好。载体的抗性基因为除草剂草丁膦抗性的Bar基因,对子叶外植体的最佳筛选浓度为8mg/L;抑制农杆菌所用Carb的有效工作浓度为400mg/L,以后继代逐次减少用量到100mg/L;按此方法以根癌农杆菌菌株EHA105介导,将双基因Bt和pta导入紫花苜蓿品种"中苜1号",最终获得122棵除草剂草丁膦(ppt)抗性的植株,经过初步的PCR及RT-PCR分子生物学检测,有30棵检测到特异性条带,表明外源基因已成功整合到苜蓿基因组中,并在转录水平得到表达。

植物表达双价抗虫载体pCAMBIA3300-bt-pta的构建

本研究将苏云金芽孢杆菌(bt)与半夏凝集素抗虫基因(pta)两类抗虫基因连接到具有高效性的植物表达载体pCAMBIA3300中,重组表达质粒分别经过ApalI单酶切及XhoI和KpnI双酶切鉴定、分析后,实验结果表明含有双价抗虫基因pCAMBIA3300-bt-pta的植物重组表达质粒已构建成功。

双价抗虫转基因水稻的育成及初步鉴定

【目的】构建双价抗虫基因表达载体并转化水稻,为选育广谱、高抗转基因抗虫水稻提供技术参考。【方法】构建半夏凝集素基因(pta)和苏云金杆芽孢菌基因(Bt)两个抗虫基因的双价表达载体p CAMBIA1301-Bt-pta,利用大肠杆菌DH5α和根癌农杆菌LBA4404转化水稻恢复系辐恢838,同时对转化植株进行GUS染色及PCR鉴定。【结果】以构建的双价植物表达载体p CAMBIA1301-Bt-pta为模板,PCR扩增到pta基因的部分片段,大小为807 bp,且该载体经HindⅢ酶切后,能得到15854 bp的中间载体p CAMBIA1301-Bt片段和2046 bp的pta基因片段。对转化植株进行GUS染色,得到3株转基因阳性植株,经PCR鉴定结果显示外源基因已成功导入水稻。【结论】通过构建双价抗虫基因表达载体并转化水稻,成功获得的转基因植株可用于水稻抗虫转基因恢复系及组合的研究,以提高其抗病虫害能力。

半夏凝集素基因的克隆及转基因烟草对蚜虫的抑制作用

采用同源序列克隆方法，通过设计特异性引物从甘肃西和半夏叶片基因组DNA中克隆到1条1069bp的半夏凝集素基因pta，与以同科内植物的mRNA为模板扩增得到的凝集素基因序列的同源性很高，达到98％以上，功能区完整，具有1条信号肽和3个甘露糖结合区，GenBank登录号AY725425。用该基因替换pBI121载体的GUS基因，正向插入35S启动子之下，构建了植物表达载体pBI—pta。通过农杆菌介导法转化烟草，从20株Kan抗性植株中得到PCR检测阳性植株14株，证明pta已整合到烟草基因组中。对随机挑取的7株PCR阳性植株进行了抗蚜虫（Myzus persicae）筛选试验，结果表明：不同株系蚜口密度抑制率在22．5％～89．4％，平均蚜口密度抑制率56．2％。

含双边界序列植物双价表达载体的构建

转基因植物的安全性是基因工程改良作物的一个重要问题。构建含双边界序列(双T-DNA区)载体,将选择标记基因和目标外源基因分开在不同的T-DNA区,通过转基因植株有性杂交及后代分离,可在转基因后代中获得无选择标记的转基因安全植株。将2个外源基因置于同一载体上,可以提高其共转化的效率。本研究构建了1个中间载体pAHC17-PTA和1个含双边界序列的植物双价表达载体pDB13PS。pAHC17-PTA含有由Ubiquitin启动子引导的具有抗虫效果的半夏凝集素基因(PTA)。pDB13PS含2个独立的T-DNA区,在其中一个T-DNA区,含两个目的基因的完整的表达盒,一个是由Ubiquitin启动子引导的半夏凝集素基因(PTA),另一个是由水稻胚乳特异表达启动子(Glutelin-B1promoter)驱动的马铃薯高赖氨酸蛋白基因的cDNA(SB401)。pDB13PS的成功构建,为提高PTA和SB401的共转化效率和获得无选择标记的转基因后代植株奠定了基础。