2018—2020年福建地区猪瘟病毒E0基因遗传变异分析

为了了解2018—2020年福建地区猪瘟病毒流行及遗传变异情况,收集福建省不同地区临床发病猪的血液和肺脏、脾脏、淋巴结等组织样本1464份,采用RT-nPCR的方法对样品进行CSFV检测,对部分CSFV阳性样品E0基因进行克隆测序。结果显示,CSFV总体阳性率为1.9%(29/1464),并获得13株CSFV E0基因序列。同源性分析发现所得13株CSFV E0基因之间的同源性在82.2%-99.7%,其中11株CSFV E0基因与1.1亚型代表毒株HCLV的核苷酸同源性为99.0%~99.9%,与Shimen株的核苷酸同源性94.1%~95.0%;1株与2.1c型参考毒株HNSD-2012核苷酸同源性为98.2%;1株与2.1d亚型毒株CSFV/JPN/2018核苷酸同源性为99.6%。遗传进化分析发现,10株CSFV与HCLV、C-ZJ-2008、Shimen和Brescia处于同一分支,属于1.1亚型;1株CSFV与HNSD-2012等位于同一分支,属于2.1c亚亚型;1株与CSFV/JPN/2018等位于同一分支,属于2.1d亚亚型。氨基酸序列分析发现,13株毒株与HCLV等代表毒株在重要的Rnase活性位点高度保守,其中2株2.1亚型毒株与HCLV毒株相比,其在第35位非关键氨基酸残基上发生由G→E的突变。结果表明福建地区CSFV流行情况趋向多样化,提示仍需加强对CSFV流行及遗传变异的持续监测,为猪瘟的诊断及有效防控奠定基础。

短短芽胞杆菌B011基因组中芽胞形成调控基因spo0E的鉴定与表达分析

短短芽胞杆菌B011是一株具有广谱抗菌活性的植物内生菌,发酵后期形成芽胞。据报道,芽胞形成调控基因Spo0E的编码产物能对Spo0A~P蛋白因子去磷酸化,从而实现芽胞形成的负调控。为了能够进一步验证B011基因组中Spo0E基因的功能和表达情况,为B011菌株的遗传改造提供候选基因,本研究基于B011全基因组序列,通过生物信息学工具预测得到了9个spo0E类似基因,并与其他已公布全基因组序列的101个短芽胞杆菌Brevibacillus菌株进行比较,结果表明短短芽胞杆菌spo0E家族基因在物种分化前就已经存在。转录组测序结果表明,FO446_19435和FO446_04050两个spo0E家族基因在B011中高表达,表达模式表现为先升高,在发酵18 h达到最高,此后下降,这两个基因均存在SQELD基序,推测这两个基因为B011中的两个主效spo0E基因。研究结果可为短短芽胞杆菌B011的进一步开发和利用提供一定的基础。

猪瘟病毒糖基化E2蛋白和E0蛋白的协同免疫保护作用

为了研究杆状病毒表达的糖基化亚单位疫苗的协同免疫保护作用,将重组杆状病毒感染Sf9细胞制备猪瘟E2、E0重组蛋白,Western blot检测蛋白表达和糖基化情况。用重组蛋白单独或联合免疫家兔,检测血清中抗体水平变化。在首免后4周用猪瘟兔化弱毒疫苗C株攻毒家兔,监测其体温变化,并运用RT-PCR检测家兔脾脏中病毒RNA。结果表明,E2、E2+E0免疫组兔均可诱导产生高水平的抗体和中和抗体,但两组间差异不显著。攻毒后E2免疫组2/5兔出现轻热症状,1/5兔脾脏病毒阳性;E2+E0组兔均未出现发热症状,也未检测到C株病毒RNA。E0组不能诱导兔产生中和抗体,但也能提供部分保护(2/5)。可见,基于E2、E0的亚单位疫苗具有良好的免疫原性,且两者联合使用具有协同作用,有望成为新型亚单位疫苗的候选抗原。

猪瘟病毒E0和E2蛋白融合表达的重组腺病毒构建及免疫保护性研究

为评价重组腺病毒融合表达猪瘟病毒(CSFV)E0和E2蛋白的免疫保护效果,本研究以CSFV基因组为模板,应用RT-PCR扩增E0和E2蛋白的编码基因,通过pET-32a载体将E0和E2基因串联,形成pET-E0-E2重组质粒。用KpnⅠ和NotⅠ双酶切pET-E0-E2得到E0-E2融合基因,定向亚克隆于穿梭载体pAdTrack-CMV中,采用"两步转化法"在细菌内同源重组,构建携带E0-E2基因的重组腺病毒转移载体质粒pAdEasy-E0-E2,经PacⅠ酶切线性化后转染人胚胎肾细胞(HEK293),成功包装出重组腺病毒(rAd-E0-E2),PCR和western blot检测表明,E0-E2基因已重组于腺病毒基因组中并获得表达。将rAd-E0-E2接种于小鼠和猪,并通过ELISA进行抗体检测。另外,将rAd-E0-E2经肌肉2次(间隔7d)免疫接种6周龄～7周龄猪,3周后用103TCID50CSFV石门株攻毒。结果表明,rAd-E0-E2免疫组6/7头存活,各组织器官带毒时间不超过10d,而非重组腺病毒rAd-CMV免疫组和空白对照组全部死亡,各组织器官均能分离到CSFV。结果提示,rAd-E0-E2能使免疫猪抵抗CSFV强毒攻击,为进一步研制猪瘟基因工程疫苗提供了实验依据。

猪瘟流行毒株E0蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立

【目的】表达猪瘟保护性抗原E0蛋白,用以建立猪瘟抗体检测方法,为进一步开发诊断试剂盒和研究E0蛋白的免疫学功能奠定基础。【方法】将猪瘟野毒株FJ237-E0基因插入原核表达载体pET32a中,以BL21(DE3)为表达菌株进行诱导表达,将表达的重组蛋白通过His亲和层析柱进行纯化,以纯化的His-E0融合蛋白作为诊断抗原,通过探索抗原包被量和抗体血清稀释倍数,建立检测猪瘟E0抗体的ELISA方法。【结果】成功克隆了CSFV E0基因,其核苷酸序列为687 bp,编码229个氨基酸。经His亲和层析柱纯化检测纯度为0.587 mg/mL;SDS-PAGE电泳结果显示,表达的E0蛋白分子质量约为50.3 ku,表达的重组蛋白为可溶性蛋白,表达量占菌体总蛋白的30%;ELISA方阵确定的最佳抗原包被量为100 ng,血清稀释倍数为1∶30,建立的ELISA方法与IDEXX公司猪瘟病毒抗体检测试剂盒的阳性符合率为92.3%,阴性符合率为85.7%。【结论】建立的ELISA检测方法,不但为猪瘟抗体监测提供了一种比较实用的血清学监测手段,也为进一步开发猪瘟抗体检测试剂盒奠定了基础。

猪瘟病毒E0蛋白的原核表达及鉴定

为获得猪瘟病毒(CSFV)E0重组蛋白,建立CSFV抗体快速检测方法。本研究通过扩增CSFV C株E0基因,亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-2,构建重组原核表达质粒pGEX-4T-2-E0,转化至宿主菌Rostta(DE3)后进行诱导表达。SDS-PAGE检测表明与目的蛋白大小一致,其分子质量大小为46ku。优化重组蛋白表达条件,最终获得诱导表达的最佳温度为37℃,最佳IPTG浓度为0.1mmol/L,并且目的蛋白以包涵体形式存在。Western blot表明,目的蛋白能与CSFV兔化高免血清反应,表明该融合蛋白具有良好的抗原性。本研究为CSFV抗体检测试剂盒的研究奠定了基础。

表达猪瘟病毒石门株E0基因重组鸡痘病毒的构建及动物免疫试验

应用PCR从质粒pMD18-T-E0中扩增编码CSFVE0蛋白的基因片段,定向克隆到重组鸡痘病毒表达载体FPV-P11上,进一步构建出重组鸡痘病毒转移载体FPV-pSY-E0。用脂质体将该质粒转染至鸡痘病毒感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)后,通过蓝斑纯化实验筛选出重组鸡痘病毒FV282-CSFV-E0。PCR证实E0基因已整合至鸡痘病毒基因组中,Western blot检测到重组病毒感染CEF细胞中E0蛋白的表达。重组病毒3次腹腔接种小鼠,ELISA检测血清抗体滴度高达1:4096。重组病毒免疫猪3次之后,接种猪瘟病毒强毒进行攻毒试验,结果对免疫组产生75%的保护率,为研制猪瘟活载体疫苗奠定了基础。

E0级人造板用微游离醛脲醛树脂的制备工艺研究

以尿素、甲醛为主要原料,聚乙烯醇、三聚氰胺为改性剂,采用分级、分步聚合反应工艺制备了微游离醛脲醛树脂。采用单因素试验法研究和优化了制备工艺,结果表明,在甲醛/尿素摩尔比为1.12∶1,加成反应pH为7.5-8.5,反应温度为60-65℃,缩聚反应pH为4.8-5.1,缩聚反应温度85-90℃条件下,添加0.4%（wt）的聚乙烯醇和4%（wt）的三聚氰胺为改性剂,制成了微游离醛脲醛树脂胶黏剂。经在杨木板材人造板中应用,该脲醛树脂胶黏剂的胶合性能和环保等级满足E0级人造板用胶黏剂的质量标准。

表达猪瘟病毒石门株E0抗原的重组腺病毒构建及免疫性的研究

应用PCR从pMD18-T-E0质粒中扩增编码CSFV E0蛋白的基因片段,定向克隆到重组腺病毒Adeasy-1系统的穿梭质粒pAdTrack-CMV上,采用细菌内同源重组“两步转化法”构建携带CSFV E0基因的重组腺病毒基因组质粒pAdEasy-E0,转染293细胞,成功包装出重组腺病毒pAd-E0,PCR证实E0基因已整合至腺病毒基因组中,用Western blot检测到重组病毒感染293细胞中E0蛋白的表达。重组病毒免疫小鼠和猪,结果2次免疫后产生明显的免疫应答,ELISA检测小鼠血清抗体滴度分别为1∶512和1∶10240;猪血清抗体滴度分别为1∶16和1∶64。本研究成功构建了表达猪瘟病毒E0基因的非复制型重组腺病毒,该重组病毒免疫小鼠可产生较高的抗体滴度,免疫猪后能提供一定的保护效果。

猪瘟病毒E0蛋白的高效表达及其间接ELISA检测方法的建立

Trizol法提取猪瘟兔化弱毒株(C株)总RNA,根据GenBank中E0基因序列设计特异性引物,扩增克隆E0基因,插入原核表达载体pET-32a(+),转化进BL2l(DE3)内进行表达。将表达的重组pET-E0蛋白通过His亲和层析柱纯化,以纯化后的蛋白为诊断抗原,包被96孔聚乙烯平板,通过探索抗原包被量和血清稀释倍数,建立检测猪瘟E0抗体的ELISA方法。通过对蛋白表达条件和ELISA反应条件的优化,确定E0蛋白能在BL2l(DE3)内高效表达,表达量达30%,蛋白分子质量约为50 ku,且蛋白以可溶性形式存在。纯化后蛋白浓度为2 mg/mL;抗原最适包被量为300 ng;血清最适稀释度为1∶50。经阻断试验、交叉反应试验和与IDEXX公司猪瘟病毒抗体检测试剂盒的符合性(83%)试验证明,建立的E0-ELISA简便、特异、稳定,为研制开发E2标记疫苗的应用和推广提供配套的检测方法。

2006—2007年陕西省古典猪瘟流行毒株E0基因的克隆及序列分析

根据GenBank上发表的古典猪瘟参考毒株Shimen毒株全基因组序列，设计并合成2对引物，采用巢式RT—PCR技术，从陕西省猪病料中成功扩增出9株猪瘟流行毒株助全基因并测定其核苷酸序列。与已发表的ALD、Alfort187、Brescia、CHVRI、CAP、Shimen、GXWZ02和HCLV等代表毒株进行同源性比较分析．核苷酸分析表明：这9株猪瘟流行毒株可以分为2大群，1株（LN163）属于群Ⅰ，与Shimen强毒株、HCI。V疫苗株和GXWZ02野毒株等代表株的同源性为80．8％～82．4％；另外8株属于群Ⅱ，毒株之间EO基因核苷酸序列的同源性为93．6％～99．6％．氨基酸序列分析表明：9株流行毒株中，群Ⅰ中的LN163毒株与我国野毒参照株GXWZ02的同源性只有83．9％，而其余8株与GXWZ02株氨基酸序列的同源性为94．4％～98．1％，形成明显不同的进化分支；同时这9株流行毒株与我国疫苗株HCLV和经典强毒株Shimen的氨基酸序列同源性分别为88．0％～89．5％和89．1％～91．8％，均呈现较明显的变异．

牛病毒性腹泻病毒梅花鹿分离株E_0基因的克隆与表达

利用RT-PCR技术扩增了牛病毒性腹泻病毒(BVDV)梅花鹿分离株E0基因,并将其克隆到pMD18-T克隆载体和pET28a原核表达载体中,构建了pMD18-T/E0和pET28a/E0重组子,并进行了测序和表达。表达产物分别用12%SDS-PAGE检测和牛抗BVDV阳性血清进行Western-blotting检测,结果表明,BVDV梅花鹿分离株E0基因的核苷酸序列与匈牙利VEDEVAC株的同源性高达98.6%,与C24V标准株的同源性为84.9%,证明构建的重组子是正确的;BVDV梅花鹿分离株E0基因得到了正确表达。

牛病毒性腹泻病毒E0基因重组慢病毒载体构建和鉴定

为构建携带牛病毒性腹泻病毒(BVDV)E0基因的重组慢病毒质粒,并检测其在HEK-293T细胞中的表达,本研究通过合成BVDV E0基因序列(AJ133739.1),构建包含Ig K信号肽的p ZJ-CMV-e GFP-Ig K-E0重组质粒和不含信号肽的p ZJ-CMV-e GFP-E0重组质粒,将其采用PEI方法分别转染HEK-293T细胞包装慢病毒,并浓缩后测定滴度,收集转染后上清液进行western blot检测蛋白表达。通过酶切、PCR及测序鉴定表明E0基因正确整合至慢病毒载体中,western blot结果表明其能够在HEK-293T细胞中表达。本研究构建获得携带BVDV E0基因的重组慢病毒,为BVDV E0蛋白哺乳动物细胞中的表达及其免疫原性研究奠定基础。

牛病毒性腹泻病毒(BVDV)E0蛋白原核表达及间接ELISA方法的建立

牛病毒性腹泻病毒(BVDV)能够引起牛羊的持续感染,临床上很难对其根除,建立该病有效检测方法对净化畜群具有重要意义。本研究构建BVDV E0蛋白基因重组表达载体在大肠杆菌中诱导表达,用重组的E0蛋白为包被抗原,确定抗原最佳包被浓度为5μg/mL,最佳血清稀释比为1∶10,最佳封闭液为5%脱脂奶粉,最佳封闭条件为37℃封闭2 h,酶标二抗稀释度为1∶5000,作用时间为30 min,样品临界值X+2S为0.278。该方法与IDEXX的BVDV间接ELISA试剂盒比较总符合率为86%,与口蹄疫病毒、牛支原体、牛传染性鼻气管炎病毒、牛副结核、牛布鲁氏菌病阳性血清无交叉反应。该检测方法能够用于BVDV抗体水平的临床检测,可为感染病畜的合理淘汰提供实验依据。

表达猪瘟病毒石门株E0和/或E2基因重组非复制型腺病毒疫苗的免疫保护试验

用已构建好的表达猪瘟病毒石门株E0基因的重组腺病毒pAd-E0、表达猪瘟病毒石门株E2基因的重组腺病毒pAd-E2以及联合表达猪瘟病毒石门株E0-E2基因的重组腺病毒pAd-E0-E2,肌肉和皮下接种免疫商品猪2次(间隔20 d),同时设非重组腺病毒PAD-CMV、常规猪瘟疫苗和空白对照组。二免21 d后进行CSFV石门株强毒超致死量(1 000倍TCID50)攻击,研究表达猪瘟保护性抗原基因重组腺病毒疫苗的免疫效果。结果表明,pAd-E0、pAd-E2和pAd-E0-E2免疫组猪的死亡率分别为50%,25%和25%,而常规猪瘟兔化弱毒疫苗免疫组的死亡率为40%,pAd-CMV免疫组和空白对照组猪全部死亡;在攻毒前,重组腺病毒免疫组抗体水平普遍较低,商品化疫苗免疫组能100%检测到抗体,而非重组腺病毒和空白对照没有检测到抗体;攻毒后pAd-E0、pAd-E2和pAd-E0-E2试验组中分别有75%,50%和50%猪体温超过40℃,常规苗试验组80%体温超过40℃,而PAD-CMV组和空白对照组所有试验猪体温均超过40℃,表明重组腺病毒疫苗具有一定的保护效果。表明,仅含有E0基因的重组腺病毒pAd-E0的免疫保护效果和常规疫苗还有距离;含有E2基因和E0-E2基因的重组腺病毒的免疫保护效果不亚于常规疫苗。

牛病毒性腹泻病毒牦牛株E0基因生物信息学分析及原核表达与抗原性检测

为研究牦牛BVDVE0蛋白的生物信息学及抗原性,本研究对本实验室克隆并测序的牦牛病毒性腹泻病毒E0基因进行了生物信息学分析;同时用含有酶切位点、起始密码子、终止密码子的引物重新扩增E0基因,并连接PMD18-T载体,经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后,将获得的E0片段克隆至PET-28A原核表达载体,构建重组质粒并转入JM109.酶切、质粒PCR鉴定正确后转入rosetta(DE3)菌进行诱导表达.经SDS-PAGE检测结果显示目的基因获得了较高的表达,表达的融合蛋白约33ku,经western-blotting检测表明目的蛋白具良好的有抗原性.

一株白牦牛源牛病毒性腹泻病毒E0基因的原核表达与序列分析

【目的】本研究旨在对来源于白牦牛的牛病毒性腹泻病毒(BVDV) GSTZ株的E0基因进行分析,并利用E0基因对GSTZ进行基因分型。【方法】通过提取牛病毒性腹泻病毒(BVDV) RNA,使用RT-PCR技术扩增BVDV E0基因,将其插入到pET-28a中,构建pET-28a-E0原核表达载体,转化BL21(DE3)感受态细胞,筛选阳性克隆,鉴定及测序。IPTG诱导后使用BVDV阳性血清作一抗,经western blot鉴定。根据E0基因的序列进行同源性分析以及构建E0基因系统发育进化树。利用DNAstar预测E0蛋白的抗原表位。【结果】本研究表达的E0蛋白大小与预期结果相符且该蛋白具有良好的抗原性。通过对E0基因序列的同源性分析以及构建E0基因系统发育进化树,说明牛病毒性腹泻病毒GSTZ株基因型可能属于牛病毒性腹泻病毒-1a亚型,也可能是其他基因亚型发生较大突变产生变异。通过预测E0蛋白B细胞的抗原表位主要位于:7-12、22-26、62-63、94-97、101-105、115-119、127-128、138-140、185-187、215-219位氨基酸残基; T细胞潜在优势抗原区域主要位于:10-14、19-31、36-43、52-58、77-86、96-98、137-140、148-150、167-191、209-211位氨基酸残基。【结论】E0蛋白具有良好的抗原性,通过对抗原表位预测以及对GSTZ进行基因分型,为后续基因工程疫苗和BVDV检测试剂盒的开发提供了理论依据。

猪瘟病毒RT-nPCR检测方法的建立及陕西部分地区猪瘟病毒E0基因分子特征分析

【目的】建立一种基于E0基因高保守性的猪瘟病毒(CSFV)RT-nPCR检测方法,为临床诊断提供一种可靠方法,同时对获得的陕西猪瘟病毒E0基因进行序列分析,揭示猪瘟病毒基因的分子衍化特征,为防控猪瘟提供参考。【方法】根据GenBank中的猪瘟病毒参考序列,设计并合成了2对引物,建立猪瘟RT-nPCR检测方法,并对该方法的灵敏度和特异性进行检测。用该方法对采自陕西部分猪场的32份疑似猪瘟病料进行检测,并对获得的8株流行毒株E0基因进行测序及同源性分析。【结果】建立了猪瘟病毒RT-nPCR检测方法,该方法检测CSFV cDNA含量的最低极限为6.7×10-5 ng/L,从BVDV、PRRSV、PCV-2、PRV和PPV等参考毒株中提取或反转录获得的DNA/cDNA中不能扩增出目的条带,提示方法灵敏度高、特异性强。对32份疑似猪瘟组织病料的检测发现,有12份呈现阳性,阳性率为37.5%。序列分析表明,8株流行毒株间E0核苷酸、氨基酸同源性分别在97.0%~99.3%和94.8%~98.5%。与参考毒株的核苷酸同源性为83.4%~95.4%,氨基酸同源性为85.8%~98.1%。流行毒株与我国疫苗毒株HCLV、C HVRI的核苷酸同源性仅为83.4%~85.1%,氨基酸同源性仅为86.1%~89.1%,呈现出较明显的远离疫苗株的变异趋势。进化树分析发现,8个流行毒株均属于基因Ⅱ群。首次发现了1株流行毒株(SXWN02株)E0Rnase活性基序位点第94位由E变异为K,其他位点未发生变异。【结论】建立的RT-nPCR检测方法灵敏度高、特异性强,可作为猪瘟病毒的临床诊断方法。陕西部分地区猪场猪瘟感染仍较严重,需要做好防控工作。流行毒株E0基因发生较大变异,尤其是在关键位点上出现变异毒株,需要密切关注。

BVDV基因E_0在人参发根的转化及其分子检测

将重组鹿源BVDV基因E0植物表达载体(pBI121/E0),通过发根农杆菌Ri介导,用叶盘法转化得到人参发根,分别用PCR、RT-PCR检测其转化情况。结果表明:获得了转鹿源BVDV基因E0人参发根,鹿源BVDV基因E0已整合到人参发根基因组中并得到了转录,为研制转基因人参发根疫苗提供了科学依据和材料。

青海牦牛BVDV E0基因的表达与抗原性检测

将青海牦牛病毒性腹泻病毒(BVDV)QHZK株的E0基因亚克隆入原核表达载体pET-32(α),构建了重组表达载体pET-32(α)-E0,然后用重组质粒转化Rosetta(DE3)感受态细胞,并利用IPTG诱导蛋白表达。表达的蛋白用His-Band镍柱进行亲合层析纯化,Western-blot鉴定表达蛋白。结果显示,E0基因可在大肠杆菌中获得表达,表达产物的分子质量约为44ku,与预计的蛋白分子质量大小一致。Western-blot分析表明,该蛋白可以与BVDV标准阳性血清产生特异性结合反应,具有良好的抗原性,为BVDV亚单位疫苗的研究奠定了基础。