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GST-pull down技术筛选毛白杨天冬氨酸蛋白酶PtoAED3互作蛋白 被引量:4
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作者 赵杰 王兵 +4 位作者 骆梅 莫黎杰 李慧 刘迪 陆海 《北京林业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第5期64-74,共11页
【目的】天冬氨酸蛋白酶属于蛋白水解酶家族,为了解析毛白杨天冬氨酸蛋白酶PtoAED3在植物生长发育中的分子调节机制,利用GST-pull down联合质谱技术,对PtoAED3的互作蛋白进行鉴定和分析。【方法】通过同源克隆获得了毛白杨PtoAED3的CDS... 【目的】天冬氨酸蛋白酶属于蛋白水解酶家族,为了解析毛白杨天冬氨酸蛋白酶PtoAED3在植物生长发育中的分子调节机制,利用GST-pull down联合质谱技术,对PtoAED3的互作蛋白进行鉴定和分析。【方法】通过同源克隆获得了毛白杨PtoAED3的CDS序列,构建含GST标签的原核表达载体pGEX-4T-PtoAED3。使用IPTG诱导GST-PtoAED3融合蛋白表达后,利用GST标签对PtoAED3蛋白进行纯化,纯化后的PtoAED3蛋白与毛白杨植株总蛋白共孵育,应用GST-pull down技术获得毛白杨总蛋白中与PtoAED3蛋白相互作用的候选蛋白,随后通过质谱技术对筛选到的候选蛋白进行鉴定与分析。【结果】通过质谱技术鉴定这些蛋白的氨基酸序列,共筛选出128个与PtoAED3特异性结合的候选互作蛋白,这些互作蛋白涉及到细胞进程、代谢过程、应激反应、生物调节、发育过程等多个生物学过程。【结论】通过GSTpull down实验联合质谱技术,筛选出毛白杨中与PtoAED3互作的候选蛋白,为研究毛白杨PtoAED3与底物或复合物的互作及其影响毛白杨生长发育的分子调节机制提供了初步方向。 展开更多
关键词 PtoAED3 GST-pull down 质谱 互作蛋白
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大菱鲆(Scophthalmus maximus)热休克蛋白SmHsp47相互作用蛋白His-pull down和质谱鉴定
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作者 朱春月 孙志宾 +3 位作者 马爱军 刘志峰 杨敬昆 赵亭亭 《海洋与湖沼》 CAS CSCD 北大核心 2021年第4期971-982,共12页
首次克隆了大菱鲆(Scophthalmus maximus)热休克蛋白SmHsp47基因。该基因cDNA序列全长为1927 bp,其中开放阅读框长度为1218 bp,编码一条长度为405个氨基酸的多肽链。结果表明,大菱鲆SmHsp47基因在肝脏、皮肤、鳃和肠等4个组织中都有表达... 首次克隆了大菱鲆(Scophthalmus maximus)热休克蛋白SmHsp47基因。该基因cDNA序列全长为1927 bp,其中开放阅读框长度为1218 bp,编码一条长度为405个氨基酸的多肽链。结果表明,大菱鲆SmHsp47基因在肝脏、皮肤、鳃和肠等4个组织中都有表达,表达量最高的组织是肝脏,表达量最低组织是鳃;25℃处理6 h后SmHsp47在皮肤中的表达量增加150多倍。利用大肠杆菌原核表达系统表达了SmHsp47的his标签融合蛋白,然后利用His-pull down技术捕获了SmHsp47的相互作用蛋白质,通过质谱分析鉴定出31种候选蛋白,其中大部分蛋白为参与翻译后修饰,蛋白转换及分子伴侣;此外还包括参与脂转运与代谢、能量产生与转换、细胞骨架、防御机制等过程的蛋白质。从31种候选蛋白中进一步筛选出3种分值较高的蛋白:未知蛋白(uncharacterized protein,A0A6A4TFV0)、胎球蛋白B(Fetuin B,A0A2U9C388)和胶原结合蛋白(collagen-binding protein,A0A2U9B608),可为后续的研究提供方向。 展开更多
关键词 大菱鲆(Scophthalmus maximus) SmHsp47 蛋白相互作用 His-pull down
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基于GST-pull down的小G蛋白Rac1活性检测体系的建立 被引量:1
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作者 甄诚 陈亮 +2 位作者 柏兆方 王芊艺 满江红 《生物技术通讯》 CAS 2011年第4期540-543,共4页
目的:根据人PAK1基因的p21结合结构域(PBD)能够特异结合GTP-Rac1的特性,构建GST-PBD原核表达质粒,并利用GST-pull down方法检测真核细胞内小G蛋白Rac1的活性。方法:将人PAK1基因的PBD结构域克隆到pGEX原核表达载体上,经诱导纯化得到GST-... 目的:根据人PAK1基因的p21结合结构域(PBD)能够特异结合GTP-Rac1的特性,构建GST-PBD原核表达质粒,并利用GST-pull down方法检测真核细胞内小G蛋白Rac1的活性。方法:将人PAK1基因的PBD结构域克隆到pGEX原核表达载体上,经诱导纯化得到GST-PBD融合蛋白,并通过GST-pull down实验评估该方法的特异性和准确性。结果:pGEX-PBD质粒构建成功;纯化得到的GST-PBD融合蛋白能够特异性地与激活形式的Rac1(GTP-Rac1)结合,并且能够准确反映血小板衍生生长因子刺激下细胞内Rac1的激活过程。结论:GST-PBD融合蛋白及其整套GST-pull down检测体系能方便有效地检测细胞内Rac1的活性。 展开更多
关键词 RAC1 小G蛋白 GST-pulldown
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一种基于荧光检测的GST-pull down改进方法的建立及对Atsttrin-TNFR2相互作用的分析 被引量:1
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作者 王重喜 罗学刚 +3 位作者 李朋彦 陈小颖 周浩 张同存 《天津科技大学学报》 CAS 北大核心 2015年第1期34-40,共7页
创建一种基于荧光检测的GST-pull down改进方法,用于蛋白质间相互作用分析.利用已确定具有相互作用的Atsttrin和TNFR2蛋白对作为实验对象,分别构建GST-Atsttrin和TNFR2-EYFP融合蛋白的原核和真核表达体系.将纯化的GST-Atsttrin与TNFR2-E... 创建一种基于荧光检测的GST-pull down改进方法,用于蛋白质间相互作用分析.利用已确定具有相互作用的Atsttrin和TNFR2蛋白对作为实验对象,分别构建GST-Atsttrin和TNFR2-EYFP融合蛋白的原核和真核表达体系.将纯化的GST-Atsttrin与TNFR2-EYFP蛋白孵育后,经离心收集复合物,通过酶标仪检测其荧光值,从而分析Atsttrin和TNFR2间的相互作用.通过荧光值的检测成功分析了Atsttrin和TNFR2间的相互作用,荧光值的检测可代替传统方法中的Western blot分析,从而简化GST-pull down分析步骤、降低操作难度、并可对缺乏特异性抗体的靶蛋白进行有效地分析. 展开更多
关键词 蛋白质相互作用 荧光检测 GST-pull down
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His-pull down联合质谱鉴定谷氨酸棒杆菌中乙酰羟酸合酶IlvN的相互作用蛋白 被引量:1
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作者 侯正杰 张权威 +5 位作者 莫晓琳 夏利 谭淼 孙全伟 马倩 陈宁 《食品与发酵工业》 CAS CSCD 北大核心 2019年第16期11-17,共7页
以谷氨酸棒杆菌关键酶乙酰羟酸合酶调节亚基IlvN的相互作用蛋白研究为切入点,筛选出与其存在相互作用的蛋白.针对实验室选育的1株缬氨酸高产菌株Corynebacterium glutamicum XV,利用his-pull down技术捕获与乙酰羟酸合酶存在相互作用的... 以谷氨酸棒杆菌关键酶乙酰羟酸合酶调节亚基IlvN的相互作用蛋白研究为切入点,筛选出与其存在相互作用的蛋白.针对实验室选育的1株缬氨酸高产菌株Corynebacterium glutamicum XV,利用his-pull down技术捕获与乙酰羟酸合酶存在相互作用的蛋白质,通过液质联用的方法对差异蛋白进行鉴定,经蛋白电泳和液质分析后,鉴定得到45种蛋白,其中,大部分蛋白为参与翻译过程的核糖体蛋白,此外,还包括参与能量产生与转换、氨基酸转运与代谢、碳水化合物转运与代谢、脂转运与代谢、信号传导等过程的蛋白质.乙酰羟酸合酶是支链氨基酸合成过程中的一个重要关键酶,与其存在相互作用的蛋白涉及代谢过程中的多个方面,这些相互作用的蛋白对于支链氨基酸的合成代谢可能产生影响,所得蛋白相互作用结果对进一步指导协调代谢工程改造具有重要的意义. 展开更多
关键词 谷氨酸棒杆菌 分支链氨基酸 蛋白相互作用 his-pull down IlvN
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GST Pull-down实验鉴定NF-κB相互作用多肽 被引量:5
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作者 李生茂 梁华平 +1 位作者 徐祥 刘东擘 《免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2006年第1期94-97,共4页
目的体外鉴定NF-κB相互作用多肽与p50和p65间的相互作用。方法首先构建GST-作用多肽融合蛋白的原核表达载体pET-42a/polypeptide及NF-κB p50和p65亚基保守结构域的原核表达载体pET22b/p50和pET22b/p65,并在大肠杆菌E.coliBL-21中诱导... 目的体外鉴定NF-κB相互作用多肽与p50和p65间的相互作用。方法首先构建GST-作用多肽融合蛋白的原核表达载体pET-42a/polypeptide及NF-κB p50和p65亚基保守结构域的原核表达载体pET22b/p50和pET22b/p65,并在大肠杆菌E.coliBL-21中诱导表达,后进行GST pull-down实验验证多肽与NF-κB p50和p65的结合效应。结果经诱导表达获得了可溶性的GST-多肽融合蛋白和具有DNA结合活性的p50p、65蛋白,GST pull-down实验证实3条多肽与p50发生特异地相互作用。结论证实3条多肽在体外能与p50发生物理性的相互作用,这为获得靶向NF-κB的功能拮抗多肽工作奠定了基础。 展开更多
关键词 GST pulldown实验 多肽 NF—κB p50/p65 蛋白间相互作用
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GST pull-down技术验证CIPK7蛋白激酶与CBL1蛋白的相互作用 被引量:3
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作者 黄聪琳 丁硕 +1 位作者 姜华 安黎哲 《兰州大学学报(自然科学版)》 CAS CSCD 北大核心 2013年第6期828-832,共5页
采用DNA重组技术,构建pGEX-4T-3-CIPK7和pET28-CBL1蛋白表达载体,转化大肠杆菌并诱导表达目的蛋白,利用亲和层析纯化法纯化GST标签、His标签融合蛋白,通过GST pull-down试验验证CIPK7与CBL1之间的相互作用.成功构建了CBL1和CIPK7的重组... 采用DNA重组技术,构建pGEX-4T-3-CIPK7和pET28-CBL1蛋白表达载体,转化大肠杆菌并诱导表达目的蛋白,利用亲和层析纯化法纯化GST标签、His标签融合蛋白,通过GST pull-down试验验证CIPK7与CBL1之间的相互作用.成功构建了CBL1和CIPK7的重组质粒,经诱导表达及纯化获得了可溶性GSTCIPK7和CBL1-His融合蛋白,GST pull-down试验证实了CBL1能够与CIPK7结合.CIPK7蛋白与CBL1蛋白之间存在直接的相互作用,为进一步研究蛋白激酶CIPK7的功能奠定了基础. 展开更多
关键词 CBL1蛋白 GST pull-down CIPK7蛋白 蛋白质相互作用
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GST pull-down验证流感病毒PB1-F2蛋白与热休克蛋白40的相互作用 被引量:2
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作者 侯佩莉 关振宏 +2 位作者 张茂林 李影 段铭 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2011年第1期202-207,共6页
为体外验证流感病毒PB1-F2与热休克蛋白Hsp40相互作用,通过两个方向的GST pull-down试验验证PB1-F2与Hsp40的相互作用。构建GST-多肽融合蛋白原核表达载体pGEX-6P-1-PB1-F2和pGEX-6P-1-Hsp40,并在大肠杆菌(E.co-li)BL21中诱导表达;构建... 为体外验证流感病毒PB1-F2与热休克蛋白Hsp40相互作用,通过两个方向的GST pull-down试验验证PB1-F2与Hsp40的相互作用。构建GST-多肽融合蛋白原核表达载体pGEX-6P-1-PB1-F2和pGEX-6P-1-Hsp40,并在大肠杆菌(E.co-li)BL21中诱导表达;构建真核表达载体pLEGFP-Hsp40及pCAGGS-PB1-F2,并分别转染293T细胞使其表达Hsp40及PB1-F2融合蛋白,然后进行GST pull-down试验验证二者的相互作用。成功地构建了两种蛋白的各种表达载体,经表达、纯化获得了可溶性的GST-多肽融合蛋白,GST pull-down试验正反两方向都证实了PB1-F2与Hsp40的相互作用,初步证实了流感病毒PB1-F2在体外能与Hsp40发生相互作用。 展开更多
关键词 GST pull-down 流感病毒PB1-F2蛋白 热休克蛋白40 蛋白质相互作用
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GST pull-down验证新城疫病毒基质蛋白与鸡importinβ1蛋白的相互作用 被引量:1
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作者 胡焱 段志强 +4 位作者 嵇辛勤 赵佳福 邓珊珊 李世静 熊建民 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期126-133,共8页
旨在利用GST pull-down技术验证新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)基质(matrix,M)蛋白与鸡importinβ1蛋白在体外的相互作用。根据NDV ZJ1株M基因和鸡importinβ1基因序列设计引物,通过PCR扩增获得NDV M基因和鸡importinβ1基因... 旨在利用GST pull-down技术验证新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)基质(matrix,M)蛋白与鸡importinβ1蛋白在体外的相互作用。根据NDV ZJ1株M基因和鸡importinβ1基因序列设计引物,通过PCR扩增获得NDV M基因和鸡importinβ1基因,将其分别定向插入到原核表达载体pGEX-6p-1和pET-32a(+)构建重组原核表达载体pGEX-6p-M、pET-32a-importinβ1,然后转化至大肠杆菌BL21(DE3)后进行IPTG诱导表达,SDSPAGE检测重组蛋白的表达情况,并对包涵体重组蛋白进行变性和复性处理。然后以GST-M重组蛋白为诱饵蛋白,His-importinβ1重组蛋白为猎物蛋白,利用GST pull-down技术验证M蛋白与importinβ1蛋白的相互作用。结果表明,成功构建了重组原核表达载体pGEX-6p-M和pET-32a-importinβ1,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)获得了正确表达。SDS-PAGE电泳检测显示GST-M重组蛋白主要以包涵体形式存在,而His-importinβ1重组蛋白以可溶性和包涵体两种形式存在。利用蛋白重折叠试剂盒获得了有活性的GST-M重组蛋白,将其作为诱饵蛋白,可以捕获并检测到His-importinβ1重组蛋白,但是GST标签蛋白不能结合His-importinβ1重组蛋白。利用GST pull-down技术证实了NDV M蛋白与鸡importinβ1蛋白在体外具有直接的相互作用,这为深入研究importinβ1蛋白在NDV M蛋白细胞核定位的分子机制以及在NDV复制和致病中的作用奠定了基础。 展开更多
关键词 新城疫病毒 基质蛋白 importinβ1蛋白 GSTpull-down 蛋白相互作用
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GST-pull down技术检测R-Ras活化蛋白抑制MCF7细胞迁移 被引量:1
10
作者 王晓雪 赵若晗 +1 位作者 孙凯 宋洁 《热带医学杂志》 CAS 2019年第6期695-698,共4页
目的运用GST-pull down技术检测真核细胞中R-Ras活化蛋白的表达,用以分析R-Ras活化蛋白影响细胞迁移的体外实验。方法筛选稳定表达pcDNA3.1、pcDNA3.1R-Ras和pcDNA3.1R-Ras38V的MCF7细胞系;同时构建pGEX6p1的融合蛋白表达载体,并使其在... 目的运用GST-pull down技术检测真核细胞中R-Ras活化蛋白的表达,用以分析R-Ras活化蛋白影响细胞迁移的体外实验。方法筛选稳定表达pcDNA3.1、pcDNA3.1R-Ras和pcDNA3.1R-Ras38V的MCF7细胞系;同时构建pGEX6p1的融合蛋白表达载体,并使其在大肠杆菌BL21中大量表达用于GST-pull down实验。进一步用Western Blot检测MCF7细胞中活化的R-Ras蛋白的表达;然后用基底膜侵袭实验进一步分析稳转后R-Ras活化蛋白对细胞迁移的影响。结果成功获得融合蛋白的表达,用GST-Pull down和Western Blot技术检测出MCF7细胞中过表达活化的R-Ras蛋白。Transwell实验显示pcDNA3.1R-Ras38V组穿膜细胞数减少,与pcDNA3.1组和pcDNA3.1R-Ras组比较差异有统计学意义(P=0.0007、0.0065)。结论过表达活化的R-Ras蛋白抑制细胞的迁移,GST-pull down技术可以检测R-Ras的蛋白活化形式,为进一步深入研究R-Ras在真核细胞中的体外功能实验提供了保障。 展开更多
关键词 GST-pull down R-Ras活化蛋白 细胞迁移
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GST pull-down联合质谱分析筛选番茄SLSPRH1的互作蛋白
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作者 丁海东 钱莹 +3 位作者 谢其慧 纪宇蓉 刘丹 蒋红亮 《扬州大学学报(农业与生命科学版)》 CAS 北大核心 2021年第6期36-41,共6页
促分裂源活化蛋白激酶(MAPK)在植物逆境应答过程中发挥重要的作用。SLSPRH1是一种丝氨酸脯氨酸富集蛋白质,作为番茄SlMPK1下游靶蛋白,参与逆境响应。然而,SLSPRH1的作用机制尚不明确。为确定SLSPRH1可能的相作蛋白,以进一步研究其作用机... 促分裂源活化蛋白激酶(MAPK)在植物逆境应答过程中发挥重要的作用。SLSPRH1是一种丝氨酸脯氨酸富集蛋白质,作为番茄SlMPK1下游靶蛋白,参与逆境响应。然而,SLSPRH1的作用机制尚不明确。为确定SLSPRH1可能的相作蛋白,以进一步研究其作用机制,构建pGEX-4T-1-SLSPRH1重组载体并转化BL21表达菌,经IPTG诱导表达和GST柱纯化,获得GST-SLSPRH1融合蛋白。通过蛋白质体外结合GST pull-down试验结合液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)分析筛选SLSPRH1的互作蛋白,共鉴定出15种蛋白质与其互作。生物信息学分析表明SLSPRH1互作蛋白主要参与植物各种代谢过程和胁迫应激反应。 展开更多
关键词 番茄 SLSPRH1 原核表达 LC-MS/MS pull down 互作蛋白
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GST pull-down联合LC-MS/MS筛选柑橘抗溃疡病转录因子CsBZIP40的互作蛋白 被引量:4
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作者 窦万福 祁静静 +7 位作者 胡安华 陈善春 彭爱红 许兰珍 雷天刚 姚利晓 何永睿 李强 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2019年第13期2243-2255,共13页
【目的】CsBZIP40是一个与溃疡病抗性相关的转录因子,本研究旨在筛选转录因子CsBZIP40在响应柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc)侵染过程中的互作蛋白,对CsBZIP40的互作网络进行分析,为柑橘抗溃疡病的分子育种提供理论... 【目的】CsBZIP40是一个与溃疡病抗性相关的转录因子,本研究旨在筛选转录因子CsBZIP40在响应柑橘溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc)侵染过程中的互作蛋白,对CsBZIP40的互作网络进行分析,为柑橘抗溃疡病的分子育种提供理论依据。【方法】采用GST pull-down技术筛选柑橘在溃疡病菌侵染过程中CsBZIP40的互作蛋白。首先,构建带有GST标签的CsBZIP40蛋白融合表达载体,经IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导表达、纯化后获得GST-CsBZIP40融合蛋白作为诱饵蛋白;然后,将GST-CsBZIP40融合蛋白固定在谷胱甘肽亲和磁珠上,用固定在亲和磁珠的GST-CsBZIP40诱饵蛋白与接种溃疡病菌或LB培养基后柑橘叶片总蛋白进行孵育,与GST-CsBZIP40诱饵蛋白结合的蛋白复合物洗脱收集后进行SDS-PAGE凝胶电泳验证。将验证成功的样品洗脱液进行液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)检测,鉴定出未侵染和侵染状态下CsBZIP40的互作蛋白,将检测到的蛋白利用甜橙基因组数据库进行注释,筛选出在溃疡病菌侵染过程中与CsBZIP40特异结合的蛋白,并进行GO、KEGG和互作网络分析。【结果】过表达CsBZIP40的转基因植株表型正常,与对照植株无明显差异。过表达CsBZIP40的转基因植株溃疡病抗性评价中病斑面积、病情指数均显著小于野生型植株,分别为野生型的45%和54%。以该转基因植株为材料成功提取出侵染溃疡病菌后和未接种溃疡病菌状态下的柑橘叶片总蛋白。成功构建出GST-CsBZIP40诱饵蛋白表达载体,诱导表达纯化出GST-BZIP40诱饵蛋白。利用GST-CsBZIP40诱饵蛋白从侵染溃疡病菌后柑橘总蛋白和未接菌柑橘总蛋白中成功钓取蛋白,并用LC-MS/MS检测。经过比对、注释和筛选,在柑橘溃疡病菌侵染过程中与GST-BZIP40特异结合的蛋白有53个,这些蛋白参与多个分子功能和通路。在这53个蛋白中,有6个蛋白(Cs1g02310、Cs3g05280、Cs3g23950、Cs6g13880、Cs7g12130、orange1.1t04973)可能与植物抗病性密切相关。数据库中已经证明53个蛋白中44个与CsBZIP40有直接或间接的互作关系。【结论】溃疡病菌侵染过程中有53个蛋白与CsBZIP40互作,根据注释6个蛋白与植物抗病性密切相关,这些蛋白可能在提高柑橘生物胁迫抗逆性方面发挥着重要的作用。 展开更多
关键词 柑橘 柑橘溃疡病 柑橘溃疡病菌 BZIP GST pull-down 互作蛋白
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GST pull-down联合质谱分析技术筛选鸡NOS2的互作蛋白 被引量:2
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作者 周鑫琦 王颖洁 +1 位作者 张文慧 张亚妮 《中国家禽》 北大核心 2020年第9期19-25,共7页
为了筛选NOS2在鸡雄性生殖细胞形成过程中的互作蛋白,通过克隆NOS2序列,构建pGEX-6p-NOS2原核表达载体且诱导表达NOS2蛋白,采用GST pull-down联合质谱分析技术筛选与鸡NOS2相互作用的蛋白质。结果显示:经GST pull-down质谱分析鉴定到31... 为了筛选NOS2在鸡雄性生殖细胞形成过程中的互作蛋白,通过克隆NOS2序列,构建pGEX-6p-NOS2原核表达载体且诱导表达NOS2蛋白,采用GST pull-down联合质谱分析技术筛选与鸡NOS2相互作用的蛋白质。结果显示:经GST pull-down质谱分析鉴定到316个与鸡NOS2相互作用的候选蛋白质,其中12个高评分蛋白具有相同的功能注释,参与精子运动调控,且主要分布在细胞质、细胞核等细胞组分中,可能通过与其它蛋白质、核酸等分子结合而参与MAPK、Notch等信号通路;质谱分析还发现GOT1蛋白与NOS2互作最为明显,该蛋白参与Notch信号通路,后续将作为重点候选互作蛋白以探究其与NOS2蛋白的互作方式。该结果为进一步探究NOS2在鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化中的调控机制奠定了实验基础。 展开更多
关键词 NOS2 GST pull-down 质谱分析技术 蛋白质相互作用
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利用GST pull-down联合质谱技术鉴定H7N9禽流感病毒PA-X的互作蛋白 被引量:1
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作者 徐国双 姜童潇 +3 位作者 郭艺迪 段铭 张茂林 关振宏 《广东农业科学》 CAS 2022年第1期121-127,共7页
【目的】为探究H7N9亚型禽流感病毒(AIV)PA-X蛋白的功能,采用GST pull-down联合质谱技术筛选与鉴定与PA-X相互作用的宿主蛋白。【方法】构建PA-X的重组表达载体pGEX-4T-PA-X,转化大肠杆菌BL21(DE3)中表达重组蛋白,并利用GST亲合树脂进... 【目的】为探究H7N9亚型禽流感病毒(AIV)PA-X蛋白的功能,采用GST pull-down联合质谱技术筛选与鉴定与PA-X相互作用的宿主蛋白。【方法】构建PA-X的重组表达载体pGEX-4T-PA-X,转化大肠杆菌BL21(DE3)中表达重组蛋白,并利用GST亲合树脂进行纯化得到GST-PA-X融合蛋白。利用GST pull-down技术,将GST-PA-X和GST对照蛋白分别与A549细胞裂解液总蛋白进行体外孵育,得到的蛋白复合物经SDS-PAGE分离后进行质谱检测分析。【结果】经GST pull-down筛选与质谱分析鉴定后得到39个高可信度的可能与PA-X互作的候选蛋白质。通过GO注释和KEGG等通路富集分析发现,这些蛋白主要参与RNA的代谢及加工、mRNA翻译及运输、多肽生物合成及基因表达的转录后调节等生物学过程。对其中评分最高的蛋白Hsp70-2与PA-X的相互作用作进一步验证,免疫荧光试验结果表明Hsp70-2与PA-X可以在细胞浆中共定位。【结论】利用GST pulldown联合质谱技术筛选到39种与PA-X互作的候选蛋白,且经免疫荧光试验证明候选蛋白Hsp70-2与PA-X存在共定位,为深入探讨PA-X在AIV生命周期中的作用机制奠定基础。 展开更多
关键词 禽流感病毒H7N9 PA-X GST pull-down 质谱 Hsp70-2 蛋白互作
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应用GST pull-down技术筛选番茄SIVQ6互作蛋白 被引量:3
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作者 原贵波 莫双榕 +5 位作者 钱莹 臧栋楠 杨帆 蒋红亮 武媛 丁海东 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2020年第15期3146-3157,共12页
【目的】含有VQ基序(VQ)的蛋白质是植物特异性蛋白质,具有保守的“FxxhVQxhTG”氨基酸序列,调节植物生长和发育。番茄SlMPK1在高温胁迫过程中发挥重要作用,酵母双杂交(Y2H)显示SlVQ6蛋白能够与SlMPK1相互作用,通过GST pull-down技术进... 【目的】含有VQ基序(VQ)的蛋白质是植物特异性蛋白质,具有保守的“FxxhVQxhTG”氨基酸序列,调节植物生长和发育。番茄SlMPK1在高温胁迫过程中发挥重要作用,酵母双杂交(Y2H)显示SlVQ6蛋白能够与SlMPK1相互作用,通过GST pull-down技术进一步验证SlMPK1与SlVQ6的互作以及SlVQ6的互作网络,为研究SlVQ6介导的高温应答信号通路奠定基础。【方法】通过pGEX-4T-1-PC-VQ6质粒构建,以含有目的基因SIVQ6的菌液为模板,设计特异性引物,扩增目的基因序列,将获得的目的基因VQ6克隆到载体pGEX-4T-1的BamHⅠ和NotⅠ的酶切位点之间,将获得的重组质粒pGEX-4T-1-PC-VQ6转入TOP10克隆菌株经IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导表达,通过GST柱亲和纯化获得目标蛋白PC-VQ6,进而获得预期GST-SlVQ6融合蛋白,通过体外磷酸化进一步确定SlVQ6是否是SlMPK1的下游底物;以GST-SlVQ6为诱饵蛋白固定于GST Sepharose Beads上,与番茄叶片总蛋白孵育后洗脱,收集洗脱液进行SDS-PAGE凝胶电泳验证,通过LC-MS/MS检测SlVQ6可能互作的候选蛋白,并对筛选的SIVQ6互作蛋白通过GO、KEGG和蛋白互作网络进行生物信息学分析。【结果】成功构建pGEX-4T-1-PC-SlVQ6基因重组表达质粒,并获得带有GST标签的GST-SlVQ6融合蛋白,其分子量大小约为54 kD;将GST-SlVQ6和His-SlMPK1进行体外磷酸化试验,SlMPK1能够磷酸化SlVQ6,而作为阴性对照的GST与SlMPK1无相互作用,且SlVQ6不存在自磷酸化的现象,表明GST-SlVQ6和His-SlMPK1具有相互作用,且SlVQ6是SlMPK1的下游底物;以GST-SlVQ6融合蛋白为诱饵蛋白(空GST为阴性对照),利用pull-down试验筛选番茄叶片组织蛋白中与SlVQ6蛋白结合的蛋白,经SDS-PAGE分离、液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)鉴定以及Mascot与蛋白数据库检索,共鉴定出37个与SlVQ6结合的蛋白,包括蛋白激酶Receptor for Activated C Kinase 1B(RACK1B),通过GO、KEGG和蛋白互作网络的生物信息学分析,表明这些蛋白参与多种信号通路,其中8个核糖体蛋白可能与高温胁迫密切相关。【结论】SlVQ6是SlMPK1的底物蛋白,且37个蛋白可能与SlVQ6互作,这些蛋白与胁迫反应有着密切的联系,可能会在提高番茄植株高温耐受性等方面发挥重要作用。 展开更多
关键词 番茄 SlVQ6 SlMPK1 pull-down 互作蛋白
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GST pull-down结合质谱技术鉴定Muted蛋白相互作用蛋白
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作者 郝振华 李巍 《医学分子生物学杂志》 CAS 2021年第6期409-414,共6页
目的鉴定Muted蛋白相互作用蛋白。方法表达并纯化GST-Muted蛋白融合蛋白,与小鼠脑组织蛋白共孵育,银染获得与Muted互作的蛋白条带,利用质谱技术获得这些条带的氨基酸序列,鉴定Muted的相互作用蛋白。结果初步鉴定出31个与Muted特异结合... 目的鉴定Muted蛋白相互作用蛋白。方法表达并纯化GST-Muted蛋白融合蛋白,与小鼠脑组织蛋白共孵育,银染获得与Muted互作的蛋白条带,利用质谱技术获得这些条带的氨基酸序列,鉴定Muted的相互作用蛋白。结果初步鉴定出31个与Muted特异结合的互作蛋白,包括外泌体蛋白、细胞骨架蛋白及马达蛋白等,进一步应用免疫共沉淀技术验证了Muted与Stxbp1的相互作用。结论从小鼠脑组织初步鉴定了Muted蛋白的结合蛋白,为进一步研究Muted蛋白在LDCVs形成和分泌过程中的功能及机制提供了新的线索。 展开更多
关键词 大致密核心颗粒 GST pull-down 质谱 Muted蛋白
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GST pull-down方法寻找组蛋白去乙酰化酶的互作蛋白研究
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作者 宫艳超 张荟 赵伟伟 《天津化工》 CAS 2018年第1期17-20,共4页
用GST pull-down方法寻找组蛋白去乙酰化酶(HDACs)的互作蛋白,发现了HDAC8新的互作蛋白烯醇酶ENO1,ENO1在糖代谢过程中发挥着重要作用,ENO1参与HDAC8复合物发挥作用的过程。
关键词 GST pull-down 组蛋白去乙酰化酶 互作蛋白
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Optical pulling force on nanoparticle clusters with gain due to Fano-like resonance
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作者 马江南 冯侣 +3 位作者 王国富 林志方 郑红霞 陈华金 《Chinese Physics B》 SCIE EI CAS CSCD 2023年第1期334-339,共6页
We demonstrate that,in a simple linearly-polarized plane wave,the optical pulling forces on nanoparticle clusters with gain can be induced by the Fano-like resonance.The numerical results based on the full-wave calcul... We demonstrate that,in a simple linearly-polarized plane wave,the optical pulling forces on nanoparticle clusters with gain can be induced by the Fano-like resonance.The numerical results based on the full-wave calculation show that the optical pulling forces can be attributed to the recoil forces for the nanoparticle clusters composed of dipolar nanoparticles with three different configurations.Interestingly,the recoil forces giving rise to optical pulling forces are exactly dominated by the coupling term between the electric and magnetic dipoles excited in the nanoparticle clusters,while other higherorder terms have a negligible contribution.In addition,the optical pulling force can be tailored by modulating the Fano-like resonance via either the particle size or the gain magnitude,offering an alternative freedom degree for optical manipulations of particle clusters. 展开更多
关键词 optical pulling force nanoparticle clusters Fano-like resonance
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长足大竹象信息素结合蛋白CbuqPBP2互作蛋白的筛选与验证
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作者 杨桦 李祥乾 +2 位作者 王帆 方睿 杨伟 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》 CSCD 北大核心 2024年第1期87-97,共11页
【目的】筛选长足大竹象(Cyrtotrachelus buqueti)信息素结合蛋白CbuqPBP2的互作蛋白,为实现利用信息物质对长足大竹象种群持续控制提供参考。【方法】利用GST pull-down联合质谱技术,对长足大竹象信息素结合蛋白CbuqPBP2的互作蛋白进... 【目的】筛选长足大竹象(Cyrtotrachelus buqueti)信息素结合蛋白CbuqPBP2的互作蛋白,为实现利用信息物质对长足大竹象种群持续控制提供参考。【方法】利用GST pull-down联合质谱技术,对长足大竹象信息素结合蛋白CbuqPBP2的互作蛋白进行筛选、鉴定和分析,并采用酵母双杂交试验验证了CbuqPBP2与信息素结合蛋白CbuqPBP1的特异性互作。【结果】GST pull-down共筛选出45个与长足大竹象信息素结合蛋白CbuqPBP2特异性结合的候选互作蛋白,包括CbuqPBP1、ND2、CYTB。这些互作蛋白主要参与细胞过程、定位、代谢过程、应激反应以及生物调控等多个生物学过程。使用酵母双杂交体系,构建了pGADT7-PBP1重组猎物质粒与pGBKT7-PBP2重组诱饵质粒,通过诱饵质粒毒性检测和自激活检测,表明重组诱饵质粒对Y2HGold酵母菌无毒性作用。共转化验证结果显示,诱饵质粒pGBKT7-PBP2共转化酵母菌株能够在TDO培养基上生长。【结论】CbuqPBP2和CbuqPBP1之间有相互作用,不同信息素结合蛋白间的互作对深入理解长足大竹象嗅觉感受机制提供了新的思路。 展开更多
关键词 长足大竹象 信息素结合蛋白 蛋白互作 酵母双杂交 GST pull-down
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Push/Pull和CONWIP/Pull生产控制模式对比分析 被引量:6
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作者 林勇 乐晓娟 付秋芳 《工业工程》 2006年第2期6-10,共5页
针对制造企业如何有效地进行生产控制的问题,对Push/Pull、CONWIP、CONWIP/Pull生产控制模式作了详细介绍,对比分析了Push/Pull、CONWIP/Pull两种混合生产控制,对混合生产控制方法做出了研究展望。
关键词 生产控制模式 Push/pull CONWIP/pull 对比分析
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