凡纳滨对虾致病菌Shewanella putrefaciens WS13中crp基因无痕敲除体系构建及功能验证

以crp为靶标基因,建立凡纳滨对虾腐败菌株腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)WS13无痕敲除方法,初步研究crp基因对S.putrefaciens WS13生物被膜形成的影响。利用Pir蛋白依赖的质粒p MMB1构建缺失载体,利用质粒pBBR1MCS-2-P_(aacC1)构建回补载体,通过同源重组方法,实现对crp基因的无痕敲除,琼脂糖凝胶电泳和测序比对结果表明成功获得crp缺失株(Δcrp)和回补株(Ccrp)。通过对S.putrefaciens WS13野生型(WT)、Δcrp和回补株Ccrp形成的生物被膜作定量分析,发现突变株Δcrp生物被膜量明显下降,回补菌株Ccrp的生物被膜量相对Δcrp明显上升,揭示crp影响S.putrefaciens WS13生物被膜形成。研究结果表明,质粒pMMB1和pBBR1MCS-2-P_(aacC1)可用于S.putrefaciens WS13基因无痕敲除与回补,成功实现对靶标基因crp无痕敲除,并证实crp是影响WS13生物被膜形成的关键基因。

香芹酚纳米乳液制备及其对腐败希瓦氏菌的抑制作用

【目的】探究使用超声波乳化法制备香芹酚纳米乳液(Carvacrol nanoemulsion,CNE)的最佳条件,并分析CNE抑制腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)的作用机制。【方法】通过正交实验优化CNE制备条件,分析乳化剂吐温-80用量、油相占比与超声时间对CNE平均粒径影响,对优化后的CNE进行平均粒径、多分散指数、形态、稳定性与抗菌活性表征,并初步探究其对腐败希瓦氏菌的作用机制。【结果】乳化剂吐温-80体积分数为11%、油相香芹酚体积分数为5%、超声时间为5 min时,CNE平均粒径最小,为(145.83±4.77)nm。优化后制备的CNE在热处理(25~100℃)条件下维持稳定,在pH接近中性时的Zeta电位绝对值较高,且在4℃下最适合贮藏。制备的CNE对腐败希瓦氏菌的最小抑菌浓度(MIC)为15.63μL/mL。腐败希瓦氏菌在CNE的处理下,其碱性磷酸酶活性上升,琥珀酸脱氢酶活性下降,蛋白质、核酸泄露量增加。推测CNE是通过破坏细胞壁完整性、细胞膜通透性和能量代谢途径抑制腐败希瓦氏菌生长。【结论】以香芹酚为原料制备的CNE对腐败希瓦氏菌具有较好抑制效果,具备作为鱼类保鲜抗菌剂的潜力。

对两株具有多种染料脱色能力的腐败交替单胞菌(Alteromonas putrefaciens)的研究

从处理印染废水的污泥中分离到两株能对多种染料脱色的细菌 ,编号为D3 2 和D4.它们对 2 1种在印染工业中常用的分属偶氮染料类、三苯甲烷染料类和蒽醌类染料均具有较强的脱色能力 .这两株细菌为革兰氏阴性 ,杆状 ,以单极生鞭毛运动 ,氧化型代谢 ,兼性厌氧 ,可以乳酸钠为唯一碳源生长 ,液化明胶 ,对石蕊牛奶胨化产酸和还原 ,产生H2 S ,可还原NOˉ3 为NOˉ2 ,细胞内无聚 β 羟基丁酸颗粒积累 ,DNA中 (G +C)的摩尔分数x分别为 4 3.7%和 4 3.2 % .经鉴定为腐败交替单胞菌 (Alteromonasputrefaciens) .图 4表 3参

低浓度微酸性电解水对纯培养及海虾中副溶血性弧菌与腐败希瓦氏菌的杀灭作用

为探究低浓度微酸性电解水(low concentration slightly acidic electrolyzed water,LcSAEW)对纯培养及海虾中的副溶血性弧菌与腐败希瓦氏菌的杀灭作用,该研究通过平板计数、生长曲线、电导率、膜电位、胞内物质渗漏量、活性氧和显微镜观察分析了LcSAEW对两种细菌的抑菌效果、细胞膜完整性以及细胞形态的影响。结果表明,有效氯浓度为4、8 mg/L的LcSAEW处理纯培养副溶血性弧菌与腐败希瓦氏菌30 s时,菌落数均降低8 lg CFU/mL以上。用10 mg/L的LcSAEW处理接种两种目标菌的海虾10 min后,菌落数分别降低1.6、1.25 lg CFU/mL。LcSAEW处理后,2种细菌的代谢活性和胞内ATP浓度均降低,而电导率、胞外DNA、蛋白质和K^(+)含量均上升。此外,膜电位呈现超极化,胞内活性氧累积,细胞形态出现凹陷、皱缩现象。综上所述,LcSAEW可以破坏细胞结构、细胞膜通透性,导致细菌活性紊乱甚至凋亡。该研究可为LcSAEW在水产品中的应用提供理论依据。

腐败希瓦氏菌的适冷机制研究进展

水产品在低温冷藏保存过程中会受低温特定优势腐败菌的污染而生成刺激性气味的代谢产物,感官发生不良变化,严重影响着冷链食品安全,其中腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)是多种水产品的特定腐败菌之一。本文通过分析腐败希瓦氏菌适冷性质与脂质、细胞膜、酶等因素之间的关系,阐述了腐败希瓦氏菌通过对脂肪酸代谢途径和细胞膜成分的改变,调节和维持细菌在低温下基本细胞膜流动性和物质交换能力,降低胞外环境的胁迫压力,并且发现胞外生物膜的形成会增强腐败希瓦氏菌冷适应能力。此外,甘油磷脂、溶血磷脂和相关酶等生物活性大分子调节合成和代谢途径能够影响腐败希瓦氏菌在低温下冷适应生长过程。转录组学研究也详细揭示了细菌通过代谢调节来维持其冷适应能力。因此,本文综述了腐败希瓦氏菌多种适冷调控机制,以期为保障水产品质量和安全提供新的思路。

不同温度下腐败希瓦氏菌(Shewanela putrefaciens)生长动力学模型的比较与评价

以冷藏大黄鱼特定腐败菌腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)为研究对象,采用修正Gompertz、修正Logistic和Baranyi方程拟合5、8、15℃和25℃条件下其在胰蛋白胨大豆肉汤中的生长动力学模型,采用Belehradek方程建立二级模型,探讨温度对腐败希瓦氏菌生长动力学的影响,并对模型的拟合优度及适用性进行评价。结果表明:温度对腐败希瓦氏菌生长动力学影响显著,其在5℃环境中延滞期较长,生长趋势得到明显抑制,当温度上升到25℃时,腐败希瓦氏菌的延滞期显著缩短,比生长速率随着温度的升高而增大,温度与延滞期及比生长速率均存在线性关系。采用均方根误差(root mean square error,RMSE)、残差平方和(residual sum of squares,RSS)、偏差度(bias factor,BF)、准确度(accuracy factor,AF)、R2对修正的Gompertz、修正的Logistic和Baranyi方程的拟合优度进行评价,修正的Logistic方程的RSS和RMSE均最小,BF和AF均最接近1,修正的Logistic模型的拟合优度最佳,适用性最强,水产品中腐败希瓦氏菌的生长情况能通过修正的Logistic模型得到较好地预测。

一株腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)培养基优化

目的:对发酵培养基(CM0847)进行优化促进腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)生长。方法:通过测定菌体在600 nm处的吸光值和菌体干重,采用单因子试验结合正交试验对培养基(CM0847)进行优化。结果:当pH为7.5,在原培养基的基础上葡萄糖、牛肉膏、氯化钠分别以10%、30%及30%的添加量,菌体密度及菌体干重最高。结论:腐败希瓦氏菌在优化后的培养基中培养,其菌体干重较原培养基(CM0847)增加了11.1168 g/L。

Shewanella oneidensis MR-1和Shewanella putrefaciens对V(Ⅴ)的还原及其影响因素

在实验室模拟培养条件下,研究Shewanella oneidensis MR-1和Shewanella putrefaciens在厌氧体系中对Ⅴ(Ⅴ)的耐性试验,探讨在不同的Ⅴ(Ⅴ)浓度、接菌量、pH值和不同蒽醌-2,6-二磺酸(AQDS)浓度下对Ⅴ(Ⅴ)还原的影响,并通过扫描电镜(SEM)和X射线光电子能谱(XPS)进行表征.结果表明Ⅴ(Ⅴ)浓度低于10mg/L时对S.oneidensis MR-1和S.putrefaciens的生长影响较小,Ⅴ(Ⅴ)浓度超过20mg/L则会抑制其生长和Ⅴ(Ⅴ)的还原;随着接菌量的增加,2种微生物对Ⅴ(Ⅴ)的还原能力逐渐增强;2种微生物最适生长pH值均为7.0左右,弱碱性环境下2种微生物对Ⅴ(Ⅴ)的还原率高于弱酸性环境;添加1mmol/L AQDS会加快2种微生物对Ⅴ(Ⅴ)的还原.菌株培养3d后通过SEM分析,S.oneidensis MR-1和S.putrefaciens进行Ⅴ(Ⅴ)还原的同时也伴有少量的吸附作用.利用XPS能谱分析表明S.oneidensis MR-1和S.putrefaciens将Ⅴ(Ⅴ)还原为Ⅴ(Ⅳ).

基于转录组学的多组学分析腐败希瓦氏菌冷适应的机制

该文基于转录组(high-throughput transcriptome sequencing,RNA-seq)分析腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)ATCC8071在低温下基因表达的差异性。结果表明,在低温条件下,S.putrefaciens中2142个基因的表达具有明显差异,其中对S.putrefaciens低温冷适应机理起重要的作用基因大量集中于脂肪酸代谢、能量代谢相关通路中。进一步对S.putrefaciens差异基因联合低温条件下脂质组学与蛋白组学数据进行分析,结果表明,在低温下S.putrefaciens基因的差异在不同基因表达层面都表现出明显的一致性,表明脂肪酸代谢与能量代谢的改变对S.putrefaciens冷适应贡献的机制。

改性SiOx/WPU涂膜对腐败希瓦氏菌生物被膜的抑制作用

为获得对水产品中腐败希瓦氏菌生物被膜具有优良抑制性能的水性聚氨酯(WPU)涂膜,以不同微观形貌的SiOx微纳米粒子为粗糙度构建因子,采用滴涂法制备SiOx/WPU涂膜,测定改性SiOx/WPU涂膜表面的疏水疏油性能、表面能、微观形貌和热稳定性能,揭示改性SiOx/WPU涂膜对腐败希瓦氏菌生物被膜的抑制机制。结果表明,以十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)改性的SiOx颗粒为粗糙度构建因子制备的C-SiOx/WPU涂膜,尽管表面氟含量最高,但其水和正十六烷接触角分别为139.0°±3.5°和0°,仅表现为疏水超亲油性,热稳定性和抗细菌黏附性最差;改性气相纳米SiOx/WPU涂膜表现为超疏水超亲油性,热稳定性最好,且可以抑制腐败希瓦氏菌的初期黏附;以改进的Stober法在同一溶剂体系中制备和改性SiOx微纳米粒子为粗糙度构建因子制备的改性微米级SiOx/WPU涂膜为超双疏表面,热稳定性较高,对腐败希瓦氏菌不可逆黏附的抑制最好,可有效降低生物被膜的代谢活性,减少胞外多糖(EPS)的分泌,培养24 h后其表面刚开始形成微菌落。本研究的超双疏性改性微米级SiOx/WPU涂膜可用于制备食品包装材料,为抗生物被膜材料在食品包装领域的应用提供技术支持。

等离子体活化水对腐败希瓦氏菌杀菌效果及机理

为探究等离子体活化水(plasma activated water,PAW)对水产品中常见的腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)的杀菌效果及其作用机制。本实验通过平板计数、荧光染色、扫描电子显微镜等方法,研究了PAW对Shewanella putrefaciens的杀菌作用以及对其细胞形态、细胞膜通透性、细胞膜电位和细胞内容物泄漏情况等指标的影响。结果表明:PAW能显著降低Shewanella putrefaciens的数量(P<0.05),经等离子体放电120 s的活化水(PAW120)处理6.0min后,菌落数对数值减少了7.44(lg(CFU/mL)),细菌形态发生皱缩和破裂,内膜和外膜通透性分别增加了989.31%和474.51%,胞内核酸、蛋白等大分子发生泄漏,电导率显著升高(P<0.05);傅里叶变换红外光谱分析结果显示,经PAW120处理后细菌细胞脂质和蛋白质结构发生变化。综上所述,PAW能够通过破坏细胞壁从而使细胞膜通透性增大、细胞内蛋白和核酸流出,最终导致细胞死亡。本研究可为PAW在水产品保鲜中的应用提供理论依据。

水产品腐败希瓦氏菌CsrA蛋白序列特征及应激响应的基因表达分析

目的:探究水产品腐败希瓦氏菌中重要转录后调控蛋白CsrA的序列特征及基因表达模式。方法:克隆腐败希瓦氏菌csrA基因,采用生物信息学手段分析CsrA结构及蛋白互作网络等,利用实时荧光定量PCR技术分析csrA对冷热、高盐、饥饿、乙醇和群体感应信号分子的应激响应表达特性。结果:CsrA为高度保守的亲水蛋白,含9个磷酸化位点,含1个α-螺旋和5个β-折叠,活性结构以二聚体形式存在,预测其互作蛋白涉及参与蛋白合成、鞭毛组装与运动、生物膜形成及群体感应调控等。4℃培养5 h显著诱导csrA基因的表达,而45℃培养1 h会立即诱导csrA基因的表达;高盐浓度能显著诱导csrA基因的表达;csrA基因在营养缺失培养基中的表达均呈逐渐升高趋势,5 h时显著高于对照组;5%乙醇处理组csrA基因表达量持续上调而10%乙醇会使csrA表达水平下降;群体感应信号分子可诱导csrA基因表达上调。结论:CsrA与腐败希瓦氏菌致腐密切相关,在其应对不同环境条件时发挥重要作用,研究结果可为进一步解析CsrA的生物学功能提供参考。

水产腐败群体感应系统与天然抑菌剂的研究进展

冷藏水产品是优质动物蛋白的重要来源之一,低温物流过程中会受微生物侵染发生腐败变质而产生不良风味。腐败细菌在生长环境中能够依靠群体效应调控自身致腐行为。综述了水产品中的特定腐败菌及群体感应的研究进展和各类天然抑菌剂在水产中的应用,分析了目前腐败希瓦氏菌作为冷藏水产品优势腐败菌的腐败能力与群体感应的关系,提出了水产品腐败机理研究的新思路。

水产品腐败希瓦氏菌外膜脂蛋白受体结构、功能及基因表达分析

外膜脂蛋白受体LolB是革兰氏阴性菌运输脂蛋白的关键因子。采用生物信息学方法和实时荧光定量PCR技术探究水产品腐败希瓦氏菌LolB的理化性质、结构和功能及其在不同环境中的基因表达变化。结果表明:lolB基因具有较高的序列保守性;其蛋白LolB分子质量约为23 ku,是稳定的亲水性蛋白,含有信号肽,具有21个磷酸化位点,不具有跨膜结构。LolB的二级结构以无规则卷曲和β-折叠为主,三级结构呈β桶状结构。预测到LolB与脂蛋白转运系统的LolA、LolC和LolE家族跨膜蛋白、ABC转运相关蛋白及增加细胞膜刚性、维持胞壁质稳定性的催化型裂解转糖酶等多种蛋白质存在相互作用。荧光定量PCR结果表明:lolB基因在菌体受到一定程度的饥饿、乙醇、渗透压及高温胁迫时上调表达,而随着胁迫程度增加呈先升后降的表达趋势;4℃条件下,lolB基因表达模式与对照组相似;外源信号分子C6-HSL诱导lolB高表达,并和LolB蛋白的Leu51残基通过π-烷基存在相互作用。研究结果旨在为解析LolB在腐败希瓦氏菌中的功能和水产品腐败希瓦氏菌的靶向抑制提供新思路。

腐殖酸对微生物还原绿脱石结构Fe(Ⅲ)的促进作用

微生物介导的铁循环是调控地表有害物质迁移转化等地球化学反应的关键因子之一。为了探明腐殖酸对微生物还原含铁黏土矿物的影响,选取了富铁黏土矿物绿脱石和不同土壤中提取到的腐殖酸为研究对象进行了实验,在有、无腐殖酸2种条件下对比了典型异化铁还原菌Shewanella putrefaciens CN32对绿脱石结构Fe(Ⅲ)的还原效率,同时分析了微生物作用后绿脱石的晶体结构差异。实验采用化学方法检测Fe(Ⅲ)的还原程度,利用X射线粉晶衍射(XRD)及傅里叶转换红外光谱(FT-IR)对微生物作用前后的绿脱石进行了矿物学表征,利用扫描电镜(SEM)研究了反应前后绿脱石的形貌差异。实验结果表明不同来源的腐殖酸均具有促进微生物还原绿脱石结构Fe(Ⅲ)的能力,但其促进效率存在差异。绿脱石中的结构Fe(Ⅲ)经微生物还原后,其矿物结构被破坏,结晶程度逐渐降低,矿物形貌由不规则片状变为松散疏松的网絮状。本研究对深入理解自然环境中铁的生物地球化学循环及其环境效应具有启示意义。

海水网箱养殖大黄鱼病原菌研究

从福建宁德地区患病大黄鱼（Ｐｓｅｕｄｏｓｃｉａｅｎａ ｃｒｏｃｅａ）肝、肾、脾等组织分离出 ３株病原 菌，进行纯化培养、人工感染、药敏试验及菌种鉴定等研究，根据形态及生理生化特征，其中 ２株致病菌归为哈维氏弧菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉ），另一株为腐败假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ ）。药敏实验的结果表明，氟哌酸、环丙氟哌酸、氯霉素、庆大霉素和复方新诺明等对致病菌 有较强的抑制作用。

冷藏养殖大黄鱼细菌相组成和优势腐败菌鉴定

从菌落和细胞形态、生理生化特征、细胞脂肪酸组成及同源性分析等方面，结合使用Sensititre、BioFosun、MIDI细菌鉴定系统对0℃、5℃冷藏养殖大黄鱼货架期终点细菌相进行定性和定量研究，确定优势腐败菌。0℃、5℃冷藏优势菌为腐败希瓦氏菌，比例分别为75．5％、59．6％，在营养琼脂和胰酶解大豆胨琼脂培养基上菌落圆状隆起，边缘整齐，透明，无色至粉红色，革兰氏阴性杆菌，极生单鞭毛，大小为（0．6-0．9）μm×（1．5-3．3）μm，最适生长温度25-35℃、最适pH7-9。菌株氧化酶和H2S呈阳性，能还原TMAO、液化明胶和Tween40，利用N-乙酰基-D-葡萄糖胺等有机物。菌体主要脂肪酸为16：1ω7c、iso-15：0、17：1ω8c、16：0，比例分别为21．31％、13．63％、9．82％、9．76％。菌株测试特征与细菌鉴定系统数据库比照，确定优势腐败菌为腐败希瓦氏菌。

茶多酚抑制腐败希瓦氏菌机理研究

研究评价了茶多酚对腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)的抑菌和杀菌效果,并初步探讨了其抑菌机理。结果表明,茶多酚对腐败希瓦氏菌的最低抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)分别为1 mg·mL-1和16 mg·mL-1,2 mg·mL-1茶多酚处理能显著抑制细菌的生长曲线,在25℃和4℃作用96 h和192 h希瓦氏菌分别下降了105 CFU·mL-1和106 CFU·mL-1,杀菌作用表现时间依赖性。茶多酚单体的杀菌能力大小分别为EGCG>ECG>EGC>EC。在茶多酚作用下,腐败希瓦氏菌胞外上清中Na+/K+-ATP酶和AKP酶活性显著上升,投射电镜(TEM)观察细菌出现了破损、变形等现象。可见,茶多酚能有效抑制腐败希瓦氏菌的生长,在低温长时间下仍表现出杀菌能力,其杀菌机制主要是引起细菌细胞壁和细胞外膜损伤,使胞内成分泄漏,导致细菌死亡。

大黄鱼腐败菌腐败能力的初步分析

研究了接种腐败希瓦氏菌菌株的大黄鱼无菌鱼块,在5℃贮藏中的感官、TVBN、TMA和腐败希瓦氏菌变化,把产生异臭味时的菌数和影响三甲胺产物的TMA产量因子(YTMA/cfu)作为腐败菌腐败能力的定量分析指标。研究结果表明,接种腐败希瓦氏菌的大黄鱼鱼块在5℃贮藏,157h后达到感官腐败点,此时TVBN、TMA值和腐败希瓦氏菌数分别为27.82mg/100g、18.01mg/100g和3.09×109cfu/g,腐败希瓦氏菌最大菌数超过腐败点菌数,可见大黄鱼鱼块的腐败是由该菌引起的,接种在鱼块上腐败希瓦氏菌的TMA产量因子为3.59×10-9mg-NTMA/cfu,揭示了腐败希瓦氏菌具有很强的腐败潜力,但腐败活性低,需要较高浓度才能引起腐败。